tag:blogger.com,1999:blog-53543448603080607902024-03-12T00:10:35.338-07:00WELBLOG : 威健生技 Welgene Biotech Co., Ltd.WELBLOG 威健生技官方部落格,不時發布火紅的生技新聞與新知、生技原理與實驗知識,同時也有威健科學老頭的最新消息。welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.comBlogger103125tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-47642776024805834382024-03-04T23:00:00.000-08:002024-03-04T23:00:00.244-08:00RNA 全長定序的最新發展<div class="separator"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhkd9DMjiK4Q2XUYzrAYYQCqwY4spf4mfl24pCL1Wl3lbjSjJlKgtw1yIIBBUz6q-I_5B4pdUMhxMLJEPhCNUXjje2TOTRwhXF8OFkShHF7wfwn4VNcnE92gyDGrkqdKx_6E9Q_b_WalMyywFkgNmTQqjSAd4nyrdY36yebkeuPUiWb80j9Z5Cmx6Xdn_c/s800/Blog.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em; text-align: center;"><img border="0" data-original-height="387" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhkd9DMjiK4Q2XUYzrAYYQCqwY4spf4mfl24pCL1Wl3lbjSjJlKgtw1yIIBBUz6q-I_5B4pdUMhxMLJEPhCNUXjje2TOTRwhXF8OFkShHF7wfwn4VNcnE92gyDGrkqdKx_6E9Q_b_WalMyywFkgNmTQqjSAd4nyrdY36yebkeuPUiWb80j9Z5Cmx6Xdn_c/s16000/Blog.jpg" /></a></div><br /><div>近年來 RNA-seq 已成為分子生物學中不可或缺的工具,對於各物種的轉錄體 ( Transcriptome ) 提供了更深入的理解。然而,在過去十多年的發展中,儘管在揭示基因表現方面取得巨大的進展,卻始終無法準確解答轉錄本 ( Transcript ) 的真正結構,以及不同分析工具估算出的基因或是轉錄本的表現量。PacBio 公司的 RNA 全長定序 ( Iso-Seq ),這項技術使我們能夠直接獲得長達 10kb 以上的轉錄異構體 ( isoforms ) 的外顯子結構 ( exonic structure ),而無須經過後續分析工具的組裝,並有助於準確地量化基因與轉錄本的表現量,使我們能夠更精確地計算差異表現基因 ( Differential Expression Gene, DEG )、差異表現轉錄本 ( Differential Expression Transcript, DET ) 以及差異轉錄本使用 ( Differential Transcript Usage, DTU ) 等分析。<br /><br /><u>Iso-Seq 的優勢總結如下:</u><br /><ul style="text-align: left;"><li>能完整定序 mRNA isoform,且無須依賴組裝過程 <span style="color: #ffa400;">( 圖一 )</span>。</li><li>每條序列能夠正確歸類於其所屬的 isoform,有助於分析轉錄體內的基因或是 isoforms 的表現特性。</li><li>即使在已知的物種中,仍能發現許多的未知的 genes 或是 isoforms。</li><li>Iso-Seq 藉由讀長上的優勢,在沒有參考基因組 ( Reference genome ) 的狀況下,也有足夠的資訊進行功能預測。</li><li>在有 Reference genome 的樣品中,能夠獲得完整選擇性剪接 ( Alternative splicing ) 以及 基因融合 ( Gene Fusion ) 等信息。</li></ul><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiwBWtaFIv7nzbnthaQ000QI2B7ccQ4HPCXEhoZ7PlKivZHDA7su5g3v_L1ec7oz5lzK-BsbPsqeyULMh5491Yxy7eVXIs9SoqHv6rTIsp_gvNIFjLCBz36uNo7_bNyU_KRzBwznv5sORRZjPBiwcLoeYBEOSPNuYjLu9HMWM6OANdGIOyJQ-gRIKAtVAE/s800/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="551" data-original-width="800" height="441" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiwBWtaFIv7nzbnthaQ000QI2B7ccQ4HPCXEhoZ7PlKivZHDA7su5g3v_L1ec7oz5lzK-BsbPsqeyULMh5491Yxy7eVXIs9SoqHv6rTIsp_gvNIFjLCBz36uNo7_bNyU_KRzBwznv5sORRZjPBiwcLoeYBEOSPNuYjLu9HMWM6OANdGIOyJQ-gRIKAtVAE/w640-h441/PIC_1.jpg" width="640" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【圖一】RNA-seq 和 Iso-Seq 的讀長差異使得 Iso-Seq 可以發現較多數量的 isoform。</td></tr></tbody></table><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">基因表現分析結果的平台差異:短片段 RNA-seq vs. 長片段分析 Iso-Seq</span></b><div><br />阿德雷德 ( Adelaide ) 大學與 PacBio<span style="color: #cccccc;">[1]</span> 於 2023 年發表的研究中,專注於揭示安格斯牛 ( Angus ) 與婆羅門牛 ( brahman ) 中複雜的轉錄差異。因此以胎兒發育中期 ( 約153天 ) 的肝臟 ( liver )。研究利用 RNA-seq 與 Iso-Seq 平台的定序,分別進行三組重複樣品的定序。為了提升 Iso-Seq 平台的數據量,樣品都使用了兩個 SMRT cells 進行定序。研究採用安格斯牛 x 婆羅門牛雜交第一代 ( GCF_003369695.1 ) 作為參考基因組進行分析,Iso-Seq 分析結果中發現了 54,692 個新的 isoform。在基因的部分,無論 RNA-seq 或是 Iso-Seq 的樣品在相同平台的表現量都呈現高度正相關性,兩個亞種之間的相關係數都能夠有 0.9 以上 <span style="color: #ffa400;">( 圖二 )</span>。然而,若使用不同定序平台,基因表現量的相關係數會降至 0.7 至 0.8 <span style="color: #ffa400;">( 圖二 )</span>。值得注意的是,在轉錄本的水平上,相關係數更是驟降至 0.2 至 0.3 <span style="color: #ffa400;">( 圖三 )</span>。作為 Iso-Seq 主要研究標的 isoforms 上,可以確定 Iso-Seq 與 RNA-seq 的分析結果在轉錄體上存在明顯的不同,就算在基因層面,相似程度也有所不同了。接著探討兩個平台表現量差異對於 DEG 與 DET 產生的影響。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgMt5EbX0wdyT5aGAiLGlFZw6XiyDzagzyQ6H2o1RUGu2qJbjPhyH8tdy9OjAjVQxr2RdsXp51nRzynky-YVb8Gnqk3H_HDphw2sNuoXCpJ-khwaMU8Zq7V8GcAYdyeGLBnfz4oX21BlYCb1kO70oqx_9OPuPbm6Ox3XiLFGTS04itwYSBQUYj6H8UUO3o/s800/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="528" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgMt5EbX0wdyT5aGAiLGlFZw6XiyDzagzyQ6H2o1RUGu2qJbjPhyH8tdy9OjAjVQxr2RdsXp51nRzynky-YVb8Gnqk3H_HDphw2sNuoXCpJ-khwaMU8Zq7V8GcAYdyeGLBnfz4oX21BlYCb1kO70oqx_9OPuPbm6Ox3XiLFGTS04itwYSBQUYj6H8UUO3o/s16000/PIC_2.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【圖二】RNA-seq 及 Iso-Seq 在基因的層級分析,樣品在相同平台的表現量都呈現高度正相關性,兩個亞種之間的相關係數都能夠有 0.9 以上,若使用不同定序平台,基因表現量的相關係數降至 0.7 至 0.8 ( 取自 Tseng et al., 2023 )。</td></tr></tbody></table><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEivODHJS5vTWV8ji3vEojkFDeUTRmAuPzJJgWMQgWxxWZiPs18SqEZKy_D2jvzyMfDUkqXQ_1f3WYXppq7QvsinZPDp6NSJCQ5i3hzS4hMjyLdGXLhoGvQMI9LoUsBt4Tgwi14e4_El2v07ozrl4rsRx3PUtGBSVkwRYWcZaRAxDpuVWAr0oak6D53j9z0/s800/PIC_3.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="638" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEivODHJS5vTWV8ji3vEojkFDeUTRmAuPzJJgWMQgWxxWZiPs18SqEZKy_D2jvzyMfDUkqXQ_1f3WYXppq7QvsinZPDp6NSJCQ5i3hzS4hMjyLdGXLhoGvQMI9LoUsBt4Tgwi14e4_El2v07ozrl4rsRx3PUtGBSVkwRYWcZaRAxDpuVWAr0oak6D53j9z0/s16000/PIC_3.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【圖三】RNA-seq 及 Iso-Seq 在轉錄本的層級分析,樣品在相同平台的表現量都呈現高度正相關性,若使用不同定序平台,基因表現量的相關係數降至 0.2 至 0.3 ( 取自 Tseng et al., 2023 )。</td></tr></tbody></table><br />根據 RNA-seq 的相關研究,差異表現工具對於結果的影響高於序列比對工具<span style="color: #cccccc;">[2]</span>。在表現量有明顯差異的情況下,Iso-Seq DEG 與 RNA-seq DEG ( count ) 都使用同樣檢定工具-limma,但兩者共同顯著的基因也僅有 37 個。因此,需要近一步檢視兩個平台數據差異的原因為何。<br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">基因表現分析結果平台差異的原因來源</span></b><br /><br /><div>在量化 RNA-seq 數據時,常面臨缺乏足夠的訊息使 Reads 歸屬於一個基因的問題,尤其發生在多重定位 ( Multimapping ) 和歸屬基因無法確定的情況<span style="color: #cccccc;">[3]</span>。儘管 RNA-seq 的各種分析工具提供了不同策略,但這兩個問題仍然沒有得到解決<span style="color: #cccccc;">[4]</span>。相較之下,Iso-Seq 每條 Reads 都代表一個 isoform,因此無需進行組裝即可確定其所屬的基因。<br /><br /><br />首先多重定位是指一個序列重複出現在基因組的不同位置。從 Iso-Seq 的結果觀察到顯著的基因受到多重定位影響較小 <span style="color: #ffa400;">( 圖四 )</span>。回顧 Consiglio 的研究<span style="color: #cccccc;">[5]</span>指出多重定位可能導致表現量高估,進而產生偽陽性的結果。而在 RNA-seq 結果為顯著的基因,受到多重定位影響的程度較高,這也可能增加了偽陽性的風險。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhv_xaadVYWjRG3eHjrb6W7NcHZTRmCKoXMXWyzi2QjfXsWe7rS7CGFHKPkrBrTaFH8c1FYEzlAeNEa3bNEfInw17VwBtpQ-kyTI0kwQPofVCrSzRQ973pUdHcvjOk37fRdOgQkY5CvM-VchaeEGRDLz8j2_A7JwZvDkgzfhyphenhyphenaHseFdqFaxUIsaxaIMnqI/s800/PIC_4.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="480" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhv_xaadVYWjRG3eHjrb6W7NcHZTRmCKoXMXWyzi2QjfXsWe7rS7CGFHKPkrBrTaFH8c1FYEzlAeNEa3bNEfInw17VwBtpQ-kyTI0kwQPofVCrSzRQ973pUdHcvjOk37fRdOgQkY5CvM-VchaeEGRDLz8j2_A7JwZvDkgzfhyphenhyphenaHseFdqFaxUIsaxaIMnqI/s16000/PIC_4.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【圖四】以 Iso-seq 分析表現顯著差異的基因受到多重定位影響較小 ( 左及中 ),而短片段 RNA-seq 受到多重定位影響較大 ( 取自 Tseng et al., 2023 )。</td></tr></tbody></table><br />另一個問題-<u>歸屬基因無法確定</u>,是指一基因組區間中有多個基因重疊於此。這問題作者使用一個基因本身在其他基因上重疊的程度來評估,結果顯示,Iso-Seq 中顯著的基因有較多與其他基因重疊的比例較高 <span style="color: #ffa400;">( 圖五 )</span>,然而根據 RNA-seq 分析軟體 FeatureCounts 默認的條件,當 reads 被定位在這些不明的基因重疊區域時會被忽略不計算,表示這些基因在短片段的 RNA-seq 研究中,容易受到歸屬基因不明的影響,而增加偽陰性的風險。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiXHjnacfvBzm4gK4nJGz-4RvopRs7_UQVPF_3E9SeZykCafKItKlhsqZrSCruwmKQi6PEwhoAkvyaaxsLSpSldC7abMHAJbtLLDeCb6n-Fvq1h4_L8bqGSOHbOnYcsxTJKGjLPCF60KbxQ9oqszIiPM_CMQSHJk2K7oi4Z3w7sUR_NxUu7jbuVWJgvbTg/s800/PIC_5.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="586" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiXHjnacfvBzm4gK4nJGz-4RvopRs7_UQVPF_3E9SeZykCafKItKlhsqZrSCruwmKQi6PEwhoAkvyaaxsLSpSldC7abMHAJbtLLDeCb6n-Fvq1h4_L8bqGSOHbOnYcsxTJKGjLPCF60KbxQ9oqszIiPM_CMQSHJk2K7oi4Z3w7sUR_NxUu7jbuVWJgvbTg/s16000/PIC_5.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【圖五】以基因彼此重疊程度來評估 RNA-seq 及 Iso-Seq 發現的表現顯著差異基因具有歸屬基因不明的數量。結果顯示,Iso-Seq 中顯著的基因較多和其他基因重疊的比例較高,推測是因 Iso-Seq 技術較不受歸屬基因不明的影響 ( 取自 Tseng et al., 2023 )。</td></tr></tbody></table><br />由於前述的分析顯示 Iso-Seq 不受多重定位及歸屬基因無法確定的影響,因此能夠準確呈現 isoforms 的表現量,進而準確的分析樣品在不同條件或狀態下的轉錄異構體切換 ( isoform switch )。這方面的分析通常稱為差異轉錄本使用 ( Differential transcript usage, DTU ) 分析,其功能主要檢定同一基因內不同 isoforms 的組成變化。根據 Iso-Seq 進行的 DTU 分析的結果,其中 MRPL49 在 Iso-Seq 的 DTU 分析中呈現顯著差異 <span style="color: #ffa400;">( 圖六 )</span>,表示 MRPL49 中的 isoforms 在不同亞種的比例有顯著的不同。其中 PB.27455.10 主要發生在安格斯牛;而 PB.27455.1 則反之。通過 PB.27455.10 及 PB.27455.1 的外顯子結構表示兩者之間僅有在 5' 端存在 52bp 的差異,而這樣的差異在 RNA-seq 的資料中是不容易被發現。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiraiH2KKX2QUligT5VZqnnYpUWNcoTwfl3t8o9aBeWFKtwQnQJ_g3XP3D7QzZaS5u8kCdmbNccpymaOGre6vcoM759a9Z26MRS2qe_Xw0ALM-KiFOvtHNCdU63BgOYBQ4EDpsZ2xm5JSmAaSZ46pmcABaMgdBrhBS5591Ta0E-oJ3vBVV0AXCrxU5igJ0/s800/PIC_6.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="269" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiraiH2KKX2QUligT5VZqnnYpUWNcoTwfl3t8o9aBeWFKtwQnQJ_g3XP3D7QzZaS5u8kCdmbNccpymaOGre6vcoM759a9Z26MRS2qe_Xw0ALM-KiFOvtHNCdU63BgOYBQ4EDpsZ2xm5JSmAaSZ46pmcABaMgdBrhBS5591Ta0E-oJ3vBVV0AXCrxU5igJ0/s16000/PIC_6.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【圖六】基因 MRPL49 在不同樣品的轉錄本之外顯子結構差異 ( 取自 Tseng et al., 2023 )。</td></tr></tbody></table><br />儘管 Iso-Seq 解決了 RNA-seq 普遍面臨的問題,也驗證了單獨 RNA-seq 的分析可能導致結果的偏誤。作者同時提了其他可能導致兩者差異的原因。首先,Iso-Seq 在進行擴增時,主要的擴增範圍可達數百甚至數千個鹼基 ( base )。然後在建立文庫的過程中,根據使用的 kit 的不同,會對 RNA 進行不同大小的篩選。最後,由於 SMRT cells 上 ZMWs 孔洞的限制,導致豐富度較低的 RNA 在上機過程中被濾去。儘管如此,Iso-Seq 還是較能呈現基因在轉錄過程中的複雜性。若長片段定序的能夠增加數據量,將能夠更深入了解 RNA 特性和基因表達的例行定量分析的準確性。<br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">長片段定序增加數據量的解方 - 以單細胞轉錄組分析為例</span></b><br /><br /><div><span style="text-size-adjust: 100%;">RNA 基因表現的動態範圍 ( dynamic range ) 為-10</span><sup><span face="PingFang TC, 微軟正黑體, Microsoft JhengHei, Helvetica, Arial, sans-serif" style="color: #111111;"><span style="background-color: white; text-size-adjust: 100%;">7</span></span></sup><span style="text-size-adjust: 100%;">-10</span><sup><span face="PingFang TC, 微軟正黑體, Microsoft JhengHei, Helvetica, Arial, sans-serif" style="color: #111111;"><span style="background-color: white; text-size-adjust: 100%;">8</span></span></sup>,一般短片段 RNA-seq 定序量多為 20 M reads,動態範圍約為 10<sup><span face="PingFang TC, 微軟正黑體, Microsoft JhengHei, Helvetica, Arial, sans-serif" style="color: #111111;"><span style="background-color: white; text-size-adjust: 100%;">7</span></span></sup>;而 PacBio flowcell 的產能輸出相對較低,約為 2M ~ 6M reads,限制了該平台在基因表現生物問題的適用性。<br /><br />因此,許多方法學研發用以解決如何提升每個奈米孔每次可讀取的序列分子數,其中於 2023 年發表的 Multiplexed ArrayS isoform sequencing ( 以下簡稱 MAS-ISO-seq ) 方法可以同時解析 RNA 轉錄異構體全長,並且產量提高 15 倍<span style="color: #cccccc;">[6]</span>!<br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">使用分子間串接組合以提高產量</span></b><br /><br /></div><div>這種方法的核心設計是將多個 cDNA 序列串接組合成一個分子 ( 稱之為「陣列」(array) ),再進行定序,然後將所得的序列拆解還原成其原來 cDNA 片段以進行分析。<br /><br />於建構好 cDNA 文庫後,將其平行分成數個 PCR 反應。在每個 PCR 反應中,加入不同的條碼序列以連接在 cDNA 的兩端,其中設計的巧妙之處在於,條碼序列的其中一股的組成核苷酸帶有 deoxy-uridine(dU),經由酵素將帶有 dU 的該股水解後,使得末端並不是平的、而是「突出」的,且這些「突出」的 DNA 序列在平行的 PCR 反應中為互補序列,因此在將兩端連接好不同的條碼序列 cDNA 匯集在一個反應管時,這些互補的兩端會將 cDNA 分子頭尾相「黏」而串接成一更長的分子 <span style="color: #ffa400;">( 圖七 )</span>,陣列中的條碼是已知的 DNA 連接反應順序 ( A、B、C、D、E 等 ),由於定序長度上限為 25000bp、若平均 cDNA 分子長度為 1500bp,則可推算出並行 PCR 反應數量的上限約為 16 個反應。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEisPSqzoHkALj8ux-xa4FpVRubkcvT-mnFcGV97ROC9ZYc4zDcVT56FgLvcrk6VQ22Ohix9AYfhjm4IQ7lAc7tBTICyQm_l9GvVTvjbKJiOsMxZdn23kr55AxJOJmhOGSJcm58yLsIVCAGSIHV2RpO092mQ7mCgAf9RTrbfkFoBbJR8cKfujmaQ_W4hVmg/s892/PIC_7.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="892" data-original-width="800" height="640" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEisPSqzoHkALj8ux-xa4FpVRubkcvT-mnFcGV97ROC9ZYc4zDcVT56FgLvcrk6VQ22Ohix9AYfhjm4IQ7lAc7tBTICyQm_l9GvVTvjbKJiOsMxZdn23kr55AxJOJmhOGSJcm58yLsIVCAGSIHV2RpO092mQ7mCgAf9RTrbfkFoBbJR8cKfujmaQ_W4hVmg/w574-h640/PIC_7.jpg" width="574" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖七】MAS-ISO-seq 的實驗流程 ( 取自 Al'Khafaji et al., 2023 )。</td></tr></tbody></table><br /><div><div><br /></div><div><b><span style="color: #6aa84f;">串接序列的拆分</span></b></div><div><br /></div>在得到每個 cDNA 串接的序列後,首先需要將所得的長讀長拆分成各自的初始 cDNA 片段,而拆分主要是藉由辨識以下序列特徵 <span style="color: #ffa400;">( 圖八 )</span>: <br /><ul style="text-align: left;"><li>cDNA 分子序列特徵,如:polyA tail、TSO 序列。</li><li>cDNA 文庫製備時的 adaptor 序列,且陣列中的條碼是已知的 DNA 連接反應順序 ( A、B、C、D、E 等 )。</li></ul><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhifj4MYmy1V4yCm6HVRDSdMoo2-0PkqbEJp5QDi2QvXQXFp5bVVhU5_WQdJONMRgbbTyRwU4ZxNi7cgn7iK3zsTkzs-JO-VAOX-0tK_fTb2j0RD-kUr2ohyUdl9OZ7AiGKXKFKG97MJ0t5x_kWLYKuUT0sAZomxlKthPp3phWohr6epmbOEo_RE4UJVas/s800/PIC_8.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="140" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhifj4MYmy1V4yCm6HVRDSdMoo2-0PkqbEJp5QDi2QvXQXFp5bVVhU5_WQdJONMRgbbTyRwU4ZxNi7cgn7iK3zsTkzs-JO-VAOX-0tK_fTb2j0RD-kUr2ohyUdl9OZ7AiGKXKFKG97MJ0t5x_kWLYKuUT0sAZomxlKthPp3phWohr6epmbOEo_RE4UJVas/s16000/PIC_8.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖八】MAS-ISO-seq 序列的結構。</td></tr></tbody></table></div><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">MAS-ISO-seq 於鑑別基因表現差異的實例驗證</span></b><br /><div>如此,MAS-ISO-seq 既可以分析全長轉錄組用可以利用其增加的數據進行基因表現差異分析。以 6,000 個腫瘤浸潤細胞毒性 T 細胞的單細胞轉錄分析,該文庫既使用短讀長定序,又進行 MAS-ISO-seq 實驗。<span style="color: #ffa400;">圖九A - </span>為短讀長定序的結果,其中細胞清楚地分成代表休眠/活化/耗盡狀態的分群狀態。<br /><br />將 MAS-ISO-seq 結果從 33M reads 向下採樣到 1.6M reads 時,可以看到數據量如何影響的群組分析的結果。隨著採樣數據的增加,細胞聚類變得更加穩定,越來越趨近於短片段的聚類 <span style="color: #ffa400;">( 圖九B、上及中圖 )</span>;且數據量越高時,可以找到顯著表現差異的 RNA 轉錄異構體的數量就越多 <span style="color: #ffa400;">( 圖九B、下圖 )</span>。<br /><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEga-XQGEImuIWVPObrwHbHIw8KbBDEUWaOQEU1PIaVrKCQecTWmG61e8FjBY8VS1JGFcH0XtvJ9H5cSR8EFkvtl-iNpvj8XQBuDEd-YLoUXKDb6Uo_Nt2fp4JYEzS8sP7GpG2Wt7O3P_gNq7gRLw6zkEbTtwPL8_bBc_VJeKRPCOsNlxHbuPT9ZSBAaJ70/s800/PIC_9.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="449" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEga-XQGEImuIWVPObrwHbHIw8KbBDEUWaOQEU1PIaVrKCQecTWmG61e8FjBY8VS1JGFcH0XtvJ9H5cSR8EFkvtl-iNpvj8XQBuDEd-YLoUXKDb6Uo_Nt2fp4JYEzS8sP7GpG2Wt7O3P_gNq7gRLw6zkEbTtwPL8_bBc_VJeKRPCOsNlxHbuPT9ZSBAaJ70/s16000/PIC_9.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【圖九】短片段讀序及長片段讀序經電腦模擬下行採樣的群組分析結果比較。(A)以短片段定序、6,260 個 CD8+ T 細胞的單細胞 UMAP 基因表現群組分析結果,(B) 電腦模擬下行採樣的 MAS-ISO-seq 分析結果;( 上圖 ) 以 UMAP 呈現電腦模擬數據量多寡對群組分析結果的影響;( 中圖 ) 以 adjusted Rand index 分析短片段及 MAS-ISO-seq 結果,顯示 MAS-ISO-seq 的 read 數量越多,兩者的基因表現相似度越高;( 下圖 ) 數據量越高時,可以找到顯著表現差異的 RNA 轉錄異構體的數量就越多。( 取自 Al'Khafaji et al., 2023 )。</td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><div><div><b><span style="color: #6aa84f;">*PacBio 已於 2023 年底推出三款 Kinnex 試劑套組,大幅提高定序的通量</span></b></div><div><br /></div><div>PacBio 已經利用 MAS-ISO-seq 這突破性的技術,分別針對單細胞 RNA<a href="https://www.welgene.com.tw/service/single_cell/single_cell_service" target="_blank">[7]</a>、全長 RNA<a href="https://www.welgene.com.tw/service/PacBio/PacBio_Iso-seq" target="_blank">[8]</a> 和 16S rDNA<a href="https://www.welgene.com.tw/service/PacBio/PacBio_16S_rDNA_full_length_sequencing" target="_blank">[9]</a> 定序的通量,推出三種應用的試劑套組 - 商品名為 Kinnex <span style="color: #ffa400;">( 表一 )</span>,結合其目前最大產能機台 - Revio,可以提供與生物特性動態範圍相符的定序產能,以符合研究的需求。</div></div><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgdcB3IET4q-UNTLsw07-U7ynvxdxoc2ZDmDyU-YJkGIpuZwF9YuPgdj3IRkJG8dY_UftzeVkSaB4VGmo53nTOXBG4h8O6Uh0HwjGycW0Xii7w5Ffihn5SRWjkSninD11qdOHnkrPh5NNQlHuIPks0bCbkvBFpI0prQ9ocSHwuUmDXCHmY-DHvX0qLi2sQ/s738/Table_1.jpg" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="226" data-original-width="738" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgdcB3IET4q-UNTLsw07-U7ynvxdxoc2ZDmDyU-YJkGIpuZwF9YuPgdj3IRkJG8dY_UftzeVkSaB4VGmo53nTOXBG4h8O6Uh0HwjGycW0Xii7w5Ffihn5SRWjkSninD11qdOHnkrPh5NNQlHuIPks0bCbkvBFpI0prQ9ocSHwuUmDXCHmY-DHvX0qLi2sQ/s16000/Table_1.jpg" /></a></div><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhlMdIhQqvfb_3K20q8OmLKdgj7ErFNdw3InRErY5vgBnpUBk4EOmsxxqZiwdu1ndJCWqr_vDxdY8xKjCXP8RB_EluGqztTC2qBg8FCCN7BnJ_BcitVqpOxAUThgUyWVy03of09HDx52cHwYXrcIlMDqMqLD2yj3Cx_Oyb8MNQSbyHL7k5eLuryI-Ygddk/s800/PIC_10.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="772" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhlMdIhQqvfb_3K20q8OmLKdgj7ErFNdw3InRErY5vgBnpUBk4EOmsxxqZiwdu1ndJCWqr_vDxdY8xKjCXP8RB_EluGqztTC2qBg8FCCN7BnJ_BcitVqpOxAUThgUyWVy03of09HDx52cHwYXrcIlMDqMqLD2yj3Cx_Oyb8MNQSbyHL7k5eLuryI-Ygddk/s16000/PIC_10.png" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【表一】PacBio MAS-ISO-seq 技術,分別針對單細胞 RNA、全長 RNA 和 16S rRNA 定序的通量,推出三種應用的試劑套組 - Kinnex;其中單細胞 RNA 串接倍數為 16 倍、全長 RNA 8 倍、16S rRNA 定序則為 12 倍。</td></tr></tbody></table><br /><br /><br /><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span><br />1. Tseng <i>et al.,</i> (2023). Long read isoform sequencing reveals hidden transcriptional complexity between cattle subspecies. <i>BMC genomics, 24</i>(1), 1-15.<br /><br /><br />2. Munster <i>et al.,</i> (2023). <i>RNA-Seq Alignment and Differential Expression Software Comparison</i> (No. DOT/FAA/AM-23/02). United States. Department of Transportation. Federal Aviation Administration. Office of Aviation. Civil Aerospace Medical Institute.<br /><br /><br />3. Robert, & Watson (2015). Errors in RNA-Seq quantification affect genes of relevance to human disease. <i>Genome biology,</i> 16, 1-16.<br /><br /><br />4. Deschamps-Francoeur <i>et al.,</i> (2020). Handling multi-mapped reads in RNA-seq. <i>Computational and structural biotechnology journal,</i> 18, 1569-1576.<br /><br /><br />5. Consiglio et al., (2016). A fuzzy method for RNA-Seq differential expression analysis in presence of multireads. <i>BMC bioinformatics,</i> 17, 95-110.<br /><br /><br />6. Al'Khafaji <i>et al.,</i> (2023). High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nat Biotechnol. Jun 8<br /><br /><br />7. <a href="https://www.welgene.com.tw/service/single_cell/single_cell_service" target="_blank">單細胞基因表現分析 Single cell gene expression profiling</a><br /><br /><br />8.<a href="https://www.welgene.com.tw/service/PacBio/PacBio_Iso-seq" target="_blank">【PacBio 第三代定序服務】Iso-Seq<br /></a><br /><br />9.<a href="https://www.welgene.com.tw/service/PacBio/PacBio_16S_rDNA_full_length_sequencing" target="_blank">【PacBio 第三代定序服務】16S full length rDNA Sequencing</a></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-34252959242215625742024-01-18T22:00:00.000-08:002024-02-04T19:59:24.932-08:00次世代定序臨床應用案例分享 - HRD 檢測於卵巢癌用藥建議<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEg50qd7e8UyOenGS5A0JiFV3Qj1qeLrRSJqODChk-ZSeII56RUS9t-kIASsG-XkyZM22OQNQ_Ho_EcRyM1sDXxxAePD2yoAhBw1XG6tmv74Cv6FJt0eaAj5W4QWowtwSFul0awNww-Jr13re5ia5fMeRjPCmX3CxWqZz-4RsESgd3Pbk0D1rnDfvQAg6kA/s800/Blog.jpg" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="526" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEg50qd7e8UyOenGS5A0JiFV3Qj1qeLrRSJqODChk-ZSeII56RUS9t-kIASsG-XkyZM22OQNQ_Ho_EcRyM1sDXxxAePD2yoAhBw1XG6tmv74Cv6FJt0eaAj5W4QWowtwSFul0awNww-Jr13re5ia5fMeRjPCmX3CxWqZz-4RsESgd3Pbk0D1rnDfvQAg6kA/s16000/Blog.jpg" /></a></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><br /></div><u> HRD 生物標記之於卵巢癌</u><br /><br />HRD 病患的腫瘤細胞其同源重組修復 ( Homologous Recombination Repair,簡稱 HRR ) 途徑失去功能,因此,同源重組缺失 ( Homologous Recombination Deficiency,以下簡稱 HRD ),可作為 PARP 抑制劑療效評估的生物標記。從 PAOLA-1<a href="https://clinicaltrials.gov/study/NCT02477644">[1]</a> 第三期臨床試驗針對晚期卵巢癌分析,結果顯示 HRD 腫瘤患者受益於 PARP 抑制劑令癌莎 ( Olaparib ) 合併癌思停 ( Bevacizumab ) 的維持治療<span style="color: #cccccc;">[2]</span>。<br /><br />由於 PARP 是 DNA 損傷修復的重要酵素,PARP 抑制劑可抑制參與修復受損 DNA 的酶,這些損傷有賴於 HRR 進行修復;在癌細胞中若 HRR 途徑失去功能,這些損傷就無法藉由同源 DNA 重組修復,進而造成 DNA 損傷累積,最終導致癌細胞死亡。<br /><br /><br /><u>卵巢癌中 HRD 盛行率</u><br /><br />大約 40-50% 的卵巢癌為 HRD 陽性,但根據 HRD 檢測方法和組織學亞型,其比例有所不同<span style="color: #cccccc;">[3]</span>。相比之下,BRCA 突變患者僅佔 HRD 患者的一半,這凸顯了在決定 PARP 抑制劑處方使用時,BRCA 突變結合 HRD 檢測的好處<span style="color: #cccccc;">[4]</span>。<br /><br /><br /><u>HRD 檢測不限於卵巢癌</u><br /><br />與 HR 途徑相關的 DNA 修復缺陷的檢測包含了乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌,這提供了這些癌種靶向 PARP 抑制劑療法的機會,而跨癌種的 HRD 檢測也在持續在優化中<span style="color: #cccccc;">[5]</span>。<br /><br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">HRD 檢測所包含的基因組訊息</span></b><div><br />HRD 檢測分成兩個部份,一為 BRCA 1/2 等 HRR 途徑的靶向捕獲基因套組的基因定序,以確認這些 HRR 途徑基因是否帶有致病變異,二為低覆蓋率的全基因組定序。這兩項檢測的結合是為了確定腫瘤細胞的同源重組功能是否發生缺失,其詳細特徵如下所述 <span style="color: #ffa400;">( 圖一 )</span>。<br /><br /><br /><u>基因組不穩定性 ( Genomic Instability,以下簡稱 GI )</u><div><br />HRD 通常包含兩個 GI 特徵,其為 HRR 途徑失去功能的後果。評估 GI 可藉由低覆蓋度的全基因組定序 ( shallow whole genome sequencing,以下簡稱 sWGS ),應使用至少 0.1X ~ 1X 進行定序覆蓋範圍,以獲得最佳效能。<br /><br />GI 經由計算基因組長片段改變 ( Large Genomic Alteration,簡稱 LGA ) 和親源拷貝缺失 ( Loss of Parental Copy,簡稱 LPC ) 以進行評分。LGA 的定義為基因組中因發生長片段重組的斷點總數。在 GI 的計算中,發生重組的兩個基因組片段的長度至少為 10Mb,相距最多 3Mb;LPC 定義為至少 10Mb 長的單倍體片段的數量。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiSm5YMEDm941-JnNgdz9yU8vtZGdurLGNYXE4AWPtCokkWgO-VV1fk-zau0u___8myZJeevG_fBSOLiYS4rtJ8HVmGVL1Hk02-ngOwA3Enaaku0y7hn-2eWMkSgpele9rHVXpVJqte-EyrL2hsLk0ntHOWcGFEXKxqwXFu6WspFt1KrJuQmdTu3ZucEBY/s800/PIC_1.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="389" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiSm5YMEDm941-JnNgdz9yU8vtZGdurLGNYXE4AWPtCokkWgO-VV1fk-zau0u___8myZJeevG_fBSOLiYS4rtJ8HVmGVL1Hk02-ngOwA3Enaaku0y7hn-2eWMkSgpele9rHVXpVJqte-EyrL2hsLk0ntHOWcGFEXKxqwXFu6WspFt1KrJuQmdTu3ZucEBY/s16000/PIC_1.png" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【圖一】HRD 檢測的演算法概述:包含 GI 特徵 ( LPC,LGA ) 及 CCNE1 基因擴增,綜合這些檢測結果以計算腫瘤為 HRD 的機率。</td></tr></tbody></table><br /><div><br /><u>拷貝數變異 ( Copy number variation,以下簡稱 CNV )</u></div><div><br />HRD 檢測尚考量 CCNE1 和 RAD51B 基因的拷貝數變異,其以 sWGS 結果進行計算。已知這兩個基因的拷貝數增加會促進同源重組效率及且對 PARP 抑制劑的治療反應較差<span style="color: #cccccc;">[6]</span>,<span style="color: #cccccc;">[7]</span>。<br /><br /><br /><u>BRCA1/2 基因的致病變異數量</u><br /><br /></div><div>HRD 檢測也應該考慮 BRCA1/2 基因致病和可能致病變異的數量,而這些致病及可能致病變異的判定,都應該遵循 ACMG 指南<span style="color: #cccccc;">[8]</span>。<br /><br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">Agilent HRR 靶向捕獲基因套組的臨床檢測</span></b><div><br />Agilent HRR 靶向捕獲基因套組<a href="https://shop.welgene.com.tw/product/reagent/agilent/ngs/SureSelect_CD_HRR17" target="_blank">[9]</a>,包含 17 個基因 <span style="color: #ffa400;">( 表一 )</span>,其中有 BRCA1/2 基因之外,尚設計 HRR 途徑和 DNA 修復相關基因及微星體不穩定位點,Agilent HRR 靶向捕獲基因套組是以雜交法捕獲這些基因的外顯子等區域進行定序,而 HRD 檢測是和法國 SeqOne 公司的雲端平台合作,將定序結果上傳至 SeqOne 雲平台,經由計算後提供 HRD 結果報告。<br /><div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiqyKO4cHSHXqjYI2G0Hh9UieyULvoBsWBaIMi8UuY3KkJcEQxw5h8bYwTV9aw0xJczNI7GZJid7h6CLbOP8a0GkWyGoMrnwfqTOIE6eUzh9PJcGxGqYHwVe7vYgdTsQ5gB8-PtiOeK8wgWcXrIUiuN92sjg7lLVkMI1l4d_CBig6WSAsCQCrwJZXsftFk/s800/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="160" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiqyKO4cHSHXqjYI2G0Hh9UieyULvoBsWBaIMi8UuY3KkJcEQxw5h8bYwTV9aw0xJczNI7GZJid7h6CLbOP8a0GkWyGoMrnwfqTOIE6eUzh9PJcGxGqYHwVe7vYgdTsQ5gB8-PtiOeK8wgWcXrIUiuN92sjg7lLVkMI1l4d_CBig6WSAsCQCrwJZXsftFk/s16000/PIC_2.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【表一】Agilent HRR 靶向捕獲基因套組所設計捕獲的 17 個基因及微星體不穩定 ( Microsatellite Instability ) 位點。</td></tr></tbody></table><br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">Agilent HRR 靶向捕獲基因套組的臨床評估</span></b><br /><br /></div><div>由於 PAOLA-1 臨床試驗的 HRD 檢測是採用 Myriad My Choice® CDx,因此透過來自 PAOLA-1 第三期臨床試驗的 368 例卵巢癌的回朔性分析實驗,並和 Myriad My Choice® CDx 的結果平行比對,主要三個結果如下:<br /><br /><br /><u>1. 與 Myriad My Choice 的結果高度一致</u><br /><br /></div><div>MyChoice® CDx 檢測與 Agilent+SeqOne HRD 平台之間的一致性超過 90% <span style="color: #ffa400;">( 表二 )</span>,在 338 位同時進行 MyChoice® CDx HRD 及 Agilent HRR 檢測的患者中 315 位的 HRD 結果一致。</div></div></div></div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjgTPjBFcn90EVOXWZjlRJ6KA7b1tYw9MSBx7_QXF5d5cTuKyN04PUXRBfeg363IfRFXJ0vB0mrN1h4fDNddeNqFhP28_ij16XyKMhZylewOrsBaE-PP6sVvgH3tKnWDABKmkhfn-MxhalM-MgKIYHjF9MYvoYZ4VEXsdm3lBZWuF5O4cWCPbCowiLcyZU/s800/PIC_3.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="454" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjgTPjBFcn90EVOXWZjlRJ6KA7b1tYw9MSBx7_QXF5d5cTuKyN04PUXRBfeg363IfRFXJ0vB0mrN1h4fDNddeNqFhP28_ij16XyKMhZylewOrsBaE-PP6sVvgH3tKnWDABKmkhfn-MxhalM-MgKIYHjF9MYvoYZ4VEXsdm3lBZWuF5O4cWCPbCowiLcyZU/s16000/PIC_3.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【表二】比較 MyChoice® CDx 檢測與 Agilent+SeqOne HRD 檢測結果,其中一致陰性有 135 例、一致陽性共 180 例,結果一致共 315 例。</td></tr></tbody></table><br /><br /><u>2. Agilent+SeqOne Platform HRD 的無法得到結論性結果的案例較少</u><br /><br />Agilent+SeqOne 平台 HRD 的結果不確定率 <span style="color: #ffa400;">( 表二 )</span> 較低 ( 1% ),而 Myriad My Choice® CDx 檢測達 7%,這可能是 Agilent+SeqOne 可以檢測腫瘤細胞含量較低的樣本 ( 測試實驗及結果後述 )。<br /><br /><br /><u>3. 針對 Myriad 檢測結果沒有定論的樣品進行分析</u><br /><br />針對 Myriad myChoice® CDx 檢測沒有定論,且接受令癌莎的 18 名病患腫瘤樣本進行了存活率分析,Agilent+SeqOne HRD 的檢測結果其中 14 名病患為 HRD 陰性、4 名為 HRD 陽性;而 HRD 陽性及 HRD 陰性存活曲線有明顯的差異 <span style="color: #ffa400;">( 圖二 )</span> ,這顯示 Agilent+SeqOne HRD 檢測可成功檢測 Myriad myChoice® CDx 結果不確定的檢體並提供預後資訊 ( HR=0.12,95% C.I.=0.01-0.95 )。於 14 名 HRD 陰性患者,皆在 40 個月內復發;相比之下,在 4 名 HRD 陽性患者中,只有一名患者在 40 個月內復發。這些臨床評估結果在 ESMO GYNAE 發表 ( 巴塞隆納,2023年2月24日 )<span style="color: #cccccc;">[10]</span>,摘要和投影片可在 ESMO 網站上取得。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjvGpdFmhKlcsIkgF4CuyjsEE-x8EMlawJsnwInPMngeZJLRuiwlFeNREFrOispOvZeM-5xJhZfQc63sb9tAw_2V4rqtSztnqUTQSpQ3J6nCUd9IJ_-dWuo-fHqjAXWuM5vUiGpj-hzOLZHESq9Dhs7elCVuOiuCLFAK0c0eRqucO-yTzqgOUQFO2SpKZg/s800/PIC_4.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="623" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjvGpdFmhKlcsIkgF4CuyjsEE-x8EMlawJsnwInPMngeZJLRuiwlFeNREFrOispOvZeM-5xJhZfQc63sb9tAw_2V4rqtSztnqUTQSpQ3J6nCUd9IJ_-dWuo-fHqjAXWuM5vUiGpj-hzOLZHESq9Dhs7elCVuOiuCLFAK0c0eRqucO-yTzqgOUQFO2SpKZg/s16000/PIC_4.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【圖二】18 名接受令癌莎治療而 Myriad 檢測不確定結果患者的 Kaplan Meier 曲線。Agilent+SeqOne HRD 陽性及陰性存活曲線呈現顯著差異證實 Agilent+SeqOne HRD 檢測可以補足 Myriad 檢測不確定結果且提供預後資訊 ( HR=0.12,95% C.I.=0.01-0.95 )。</td></tr></tbody></table><br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">Agilent+SeqOne HRD 檢測的技術評估</span></b><br /><br />Agilent+SeqOne HRD 檢測同時也進行以下更多樣品的分析評估<br /><br /><br /><u>1. 重複性分析</u><div><br />針對 47 人進行 BRCA 變異的重複性檢測。確認這 47 個樣本的 BRCA 變異檢測結果全部可重複。<br /><br /><br /><u>2. 使用兩種不同定序儀進行再現性實驗</u></div><div><br />分別在兩個不同的實驗室進行 llumina NextSeq 和 NovaSeq 的定序分析,一致性為 95.7% ( 90/94 )。<br /><br /><br /><u>3. 藉由稀釋實驗以檢查低腫瘤細胞占比對結果的影響</u></div><div><br />選取 4 個 HRD 陽性、且腫瘤細胞占比 >50% 的腫瘤樣品進行稀釋實驗,這些腫瘤 DNA 分別以對應患者的正常組織 DNA 進行系列稀釋,系列稀釋的 DNA 經由 HRD 檢測後進行分析結果是否仍然呈現陽性,比對結果顯示 Agilent+SeqOne HRD 檢測腫瘤細胞占比最低容許量為 20%。</div><div><br /></div><div><br /></div><div><b><span style="color: #0b5394;">各個 HRD 檢測平台的比較</span></b></div><div><b><span style="color: #3d85c6;"><br /></span></b></div><div><div style="font-weight: bold; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjqhqSNbg1LVCoCM9UmmX4uGNL3XvjDaoq1gX5oSC4UreO-EmQjLu-oUctt4zGBZmf4587yemxP7bRh7E_T08IKnDgqbVgkxsfTH16zWAyJSOUctxeJoysl6e3wyWEA7xD8GC0SEotKzh34AWAGvIKogadhmfFz4VD96XMX6DA0wy8pEKZpjmJ2O6uRpUk/s800/PIC_5.jpg"><img border="0" data-original-height="544" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjqhqSNbg1LVCoCM9UmmX4uGNL3XvjDaoq1gX5oSC4UreO-EmQjLu-oUctt4zGBZmf4587yemxP7bRh7E_T08IKnDgqbVgkxsfTH16zWAyJSOUctxeJoysl6e3wyWEA7xD8GC0SEotKzh34AWAGvIKogadhmfFz4VD96XMX6DA0wy8pEKZpjmJ2O6uRpUk/s16000/PIC_5.jpg" /></a></div><br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">如何進行 Agilent+SeqOne HRD 的臨床診斷</span></b></div><div><br /></div><div><br /><u>1. 樣品 QC</u></div><div><br />腫瘤細胞占比應大於 20%<br /><br /><br /><u>2. HRD 檢測的文庫製備及定序</u></div><div><br />Agilent HRR 靶向捕獲基因套組採用 DNA 雜交法以捕獲標的 17 個基因相關區域進行定序 <span style="color: #ffa400;">( 圖三 )</span>,步驟包含 DNA fragmentation、End Repair/A-tailing、Adaptor ligation、Clean-up、PCR sample-indexing 以建立初始文庫、Clean-up、Hybrid-capture、Wash and PCR 以擴增 HRD 捕獲文庫、QC,其中初始文庫及 HRD 捕獲文庫 DNA 留為定序分析;整個流程,可以手動操作,也可以視需要導入<a href="https://shop.welgene.com.tw/product/instrument/agilent/ngs_automation/Magnis_NGS_Prep_System" target="_blank">自動化機台 - Magnis</a><a href="https://shop.welgene.com.tw/product/instrument/agilent/ngs_automation/Magnis_NGS_Prep_System" target="_blank">[11]</a>。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhbjdNsGTiAo8wGNtzhuujMAYsu4wairGoWMK1AvBw2bxbxTotNmtjhD3jSfl0CPs-jPZocHSoe2_JUWj8fu0VCUDZkTTu8UvTDnPUYiyhsDFsQSX4NpnmEtuvfctNOY1IGoHWOg3PoOLguIH67FB6aJ40ZnpIMpvJipCgorkAfqRmB1X64hopKLFA7XQA/s800/PIC_6.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="621" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhbjdNsGTiAo8wGNtzhuujMAYsu4wairGoWMK1AvBw2bxbxTotNmtjhD3jSfl0CPs-jPZocHSoe2_JUWj8fu0VCUDZkTTu8UvTDnPUYiyhsDFsQSX4NpnmEtuvfctNOY1IGoHWOg3PoOLguIH67FB6aJ40ZnpIMpvJipCgorkAfqRmB1X64hopKLFA7XQA/s16000/PIC_6.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【圖三】HRD 檢測的流程,包含文庫製備和 QC,整體流程需時約 9 小時,用戶可決定以手動操作,或導入自動化機台 Magnis。</td></tr></tbody></table><br /><br /><u>3. 定序規格及 QC</u><br /><br />( i ) 2X150 bp,以 Illumina Nextseq Mid Output flowcell 分析為例 <span style="color: #ffa400;">( 表三 )</span>,Agilent HRR 靶向捕獲基因套組 + sWGS 文庫合併上機,一片 flowcell 可以分析 8 個樣品<br />( ii ) onTarget% 應高於 50%<br />( iii ) Agilent HRR 靶向捕獲基因套組基因組的涵蓋倍率應大於 1000X,定序量 ~1 Gb,( UMI 去除前的覆蓋率應大於 1000X,或去除後 UMI 的覆蓋率應大於 200x )<br />( iv ) sWGS 所需的最低覆蓋度是 0.1X,建議覆蓋率至少為 1X,定序量 ~3.5 Gb,以獲得最佳效能<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgyOIFQ7_SeDToJ8n8QNh-EyIRkBYnKRWjxydGmUGCqx9ypIAM_SAR1C-6OM98KgmdAZbyWsAHTmCoYukaCSAGqIf_vN2BuelrMgiMsE1gXhkGxFehwrVdjbzgS_GEKPvd5RiF1xNVq9kvXpAOcz2DrsgV0sSUmxIjXYPY7UuDyMlwYp-0szxxsA_rJWhA/s800/PIC_7.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="225" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgyOIFQ7_SeDToJ8n8QNh-EyIRkBYnKRWjxydGmUGCqx9ypIAM_SAR1C-6OM98KgmdAZbyWsAHTmCoYukaCSAGqIf_vN2BuelrMgiMsE1gXhkGxFehwrVdjbzgS_GEKPvd5RiF1xNVq9kvXpAOcz2DrsgV0sSUmxIjXYPY7UuDyMlwYp-0szxxsA_rJWhA/s16000/PIC_7.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【表三】以 NextSeq Mid Output flowcell 為例建議的上機樣品量。如果 Agilent HRR 靶向捕獲基因套組 + sWGS 文庫合併上機,一片 Mid Output flowcell 可以分析 8 個樣品,若 HRR 靶向捕獲基因套組 + sWGS 文庫分開上機,只上機 Agilent HRR 靶向捕獲基因套組文庫可以分析 32 個樣品,只上機 sWGS 文庫可以分析 10 個樣品。</td></tr></tbody></table><br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">HRD 檢測流程安排</span></b><br /><br /><div>HRD 檢測流程考量報告時間限制及成本效益兩個因素,可規劃兩個流程 - 分別為快速流程及經濟流程 <span style="color: #ffa400;">( 圖四 )</span>。快速流程即為 HRR 基因捕獲和 sWGS 平行進行分析,是省時的方法;經濟流程是先進行 HRR 基因捕獲定序以確定 BRCA 突變狀況,若 BRCA 未突變再進行全基因組定序,不失為一經濟有效的方法。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhIySMHj6WHZ8rVWFarbg19KGSxJ4w62G00JLe3wboU47n5vxzVywKVhPBW7UyiPw6dEAfF6fu85HDo7gD2AQIK1YBlEKAx84mx_Oh95locmo5yxufWMaaV4FxzzLYe2h77ShCVs4m8Ky2pD1h7Je5DBXkrP8a5O-wFpdL1EvZnMiDsGuwWK38TYlArKkk/s800/PIC_8.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="310" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhIySMHj6WHZ8rVWFarbg19KGSxJ4w62G00JLe3wboU47n5vxzVywKVhPBW7UyiPw6dEAfF6fu85HDo7gD2AQIK1YBlEKAx84mx_Oh95locmo5yxufWMaaV4FxzzLYe2h77ShCVs4m8Ky2pD1h7Je5DBXkrP8a5O-wFpdL1EvZnMiDsGuwWK38TYlArKkk/s16000/PIC_8.png" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖四】實驗室可以使用兩種不同的排程來進行 HRD 檢測。</td></tr></tbody></table><br /><br /><br /><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span><br />1. <a href="https://clinicaltrials.gov/study/NCT02477644" target="_blank">https://clinicaltrials.gov/study/NCT02477644</a><br /><br />2. Ray-Coquard et al. (2019). Olaparib plus bevacizumab as first-line maintenance in ovarian cancer. New England Journal of Medicine, 381(25), 2416-2428.<br /><br />3. da Cunha Colombo Bonadio, R. R., Fogace, R. N., Miranda, V. C., & Diz, M. D. P. E. (2018). Homologous recombination efficiency in ovarian cancer: a review of its epidemiology and management. Clinics, 73.<br /><br />4. Weichert et al. (2022). Assessing homologous recombination deficiency (HRD) in ovarian cancer: Optimizing concordance of the regulatory-approved companion diagnostic and a next-generation sequencing (NGS) assay kit<br /><br />5. Pacheco-Barcia et al. (2022). The Homologous Recombination Deficiency Scar in Advanced Cancer: Agnostic Targeting of Damaged DNA Repair. Cancers, 14(12), 2950.<br /><br />6. Stronach E.A. et al. (2018). Biomarker Assessment of HR Deficiency, Tumor BRCA1/2 Mutations, and CCNE1 Copy Number in Ovarian Cancer: Associations with Clinical Outcome Following Platinum Monotherapy Biomarkers of Ovarian Cancer and Survival Outcome. Molecular Cancer Research, 16(7), 1103-1111<br /><br />7. Bai, S., & Buckanovich, R. J. (2021). Therapeutic approaches for CCNE1-amplified HR-proficient ovarian cancer. Cancer Research, 81(13_Supplement), 2060-2060.<br /><br />8. Richards, S., et al. (2015). Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in medicine, 17(5), 405-423.<br /><br />9. <a href="https://shop.welgene.com.tw/product/reagent/agilent/ngs/SureSelect_CD_HRR17" target="_blank">SureSelect CD HRR17 - SureSelect HRR 靶向捕獲基因套組</a><br /><br />10. Boidot, R., et al. (2023). Clinical evaluation of a low-coverage whole-genome test for homologous recombination deficiency detection in ovarian cancer. ESMO Open 8.1<br /><br />11. <a href="https://shop.welgene.com.tw/product/instrument/agilent/ngs_automation/Magnis_NGS_Prep_System" target="_blank">Magnis NGS Prep System - Magnis NGS 樣品製備系統</a>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-22686755037219342442023-02-01T00:30:00.001-08:002023-02-01T23:08:04.029-08:00【SureSelect RNA Capture 應用介紹 - 4】癌症 Gene Fusions — 腫瘤新抗原 (tumor neo-antigen) 新焦點<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh20cgPaDYz1em4ZQU8py0MuLrrnsuaaGjEzxrDEJRp3pDLEq5fE7iCU2kpjmMdQ8-8CyxkAtYHOD9nOgyS9tAfrC24fFS06wy_ZrcGoPD0W1plyw1b93vLccnhOctq6UdNfV1qHu6CM0gQYhrbRvMUWzoBsJlpfP6Wl4-7PqL651mQtce-BeiG1hpy/s800/BLOG.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="450" data-original-width="800" height="360" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh20cgPaDYz1em4ZQU8py0MuLrrnsuaaGjEzxrDEJRp3pDLEq5fE7iCU2kpjmMdQ8-8CyxkAtYHOD9nOgyS9tAfrC24fFS06wy_ZrcGoPD0W1plyw1b93vLccnhOctq6UdNfV1qHu6CM0gQYhrbRvMUWzoBsJlpfP6Wl4-7PqL651mQtce-BeiG1hpy/w640-h360/BLOG.jpg" width="640" /></a></div><div><br /></div>癌症由許多變異類型所驅動,包括 single-nucleotide substitution ( SNV, 單點突變 )、small insertion and deletion ( INDEL, 微小插入或缺失 )、copy-number variation ( CNV, 大片段增加或減少 )、absence of heterozygosity ( AOH, 染色體異質性發生異常 )、large structural variation ( SV, 染色體大型結構變異 ) 等。其中 gene fusions ( GFs, 基因融合,為 RNA 層次稱呼;DNA 層次稱為 translocation ) 為染色體大型結構變異的下游現象,於某些癌種中扮演關鍵角色。為人熟知的 gene fusions 有 BCR-ABL、NTRK fusions,它們除了診斷上的價值外,也成為不定腫瘤/組織療法 ( histology-agnostic therapy ) 的重要開發標的。<br /><br />德國 TRON 轉譯癌症中心,為一非營利獨立生藥轉譯研究中心,位在谷騰堡 - 美茵茲大學 ( Johannes Gutenberg-Universität Mainz ) 校園內。趨勢上 WES 或 RNA-seq 越來越成為癌症 FFPE 樣品的標準實驗,因此研究團隊從臨床 FFPE RNA-seq 切入,演算分析出 RNA fusion 序列,開發個人化免疫治療。過往的 gene fusion 偵測演算法多基於高品質 DNA/RNA 所獲得的數據,與真實臨床樣品狀態具有落差,偵測分析時也未考量正常組織常見的良性 SV ( 如 KANSL-ARL17A/B ),或是相連基因的讀穿融合 ( cis-near read-through fusion,如 CTBS-GNG5 )。因此 TRON 研究團隊以 FFPE RNA 數據搭上 neo-antigen 機器學習演算,開發出新的 fusion 預測工具 — EasyFuse ( <a href="https://github.com/TRON-Bioinformatics/EasyFuse" target="_blank">https://github.com/TRON-Bioinformatics/EasyFuse</a> )。該團隊將預測的融合接點處 neo-peptides 進行 CD4+ 跟 CD8+ T 細胞免疫測試,獲得良好成果並發表在 2022 年 8 月的 <i>Nature Biotechnology</i> 期刊。以下是他們的研究內容:<br /><br /><br /><b><span><span style="color: #6aa84f;">1. 樣品與分析測試方法</span><br /></span></b><br />作者團隊使用了數種樣品,包含 MCF7 及 SKBR3 這兩個已知具有 gene fusions 的乳腺癌細胞株、14 個 fresh-frozen ( FF ) 三陰性乳癌 ( Triple-Negative Breast Cancer, TNBC ) 樣品、以及 14 個不同癌種轉移狀態的 FFPE 樣品。每個樣品都技術二重複製備了 SureSelect V6 RNA 文庫,各文庫皆進行 50PE/75M 定序。定序數據以五個常見的 RNA fusion 分析工具 ( FusionCatcher、InFusion、SOAPfuse、STAR-Fusion、MapSplice2 ) 及作者團隊的 EasyFuse 進行分析預測。預測出的 fusions 再以 RT-qPCR 進行驗證。<div><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">2. 評估 MCF7 與 SKBR3 細胞株的 gene fusions 預測結果</span></b><br /><br />過往文獻發現 MCF7 與 SKBR3 細胞株存在 54 個 gene fusions ( 其中有 34 個能在作者團隊的樣品以 qPCR 驗證到 ),五個常見的分析工具皆能在二重複的 RNA 數據裡穩定算出 29-33 個。除了已知的 gene fusions 外,這些分析工具分別產生數十、數百個或更多的 gene fusion 預測 <span style="color: #ffa400;">( 圖1a )</span>。統合所有的 gene fusion 預測結果,僅有 12% 是在二重複數據中有再現 <span style="color: #ffa400;">( 圖1b )</span>。爾後作者團隊挑了 133 個 gene fusion 預測結果進行 qPCR 驗證 ( 並確認產物片段大小 ),只在單一工具算出的 gene fusions ( n=33 ) 驗證度為 61% <span style="color: #ffa400;">( 圖1c )</span>;同時被多個工具或二重複數據都有被算出的 gene fusions 驗證度略高,達 65-81%。測試結果顯示,兩個細胞株內的 gene fusions 種類及數量,可能比文獻已知的多出不少,另外多工具的共同預測結果還有明顯的無法驗證率,因此難以只用文獻已知 fusions 及跨工具的共同預測結果,作為樣品內 fusions 族群真實存在樣貌。</div><div><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">3. 評估三陰性乳癌冷凍組織樣品預測結果</span></b><br /><br />接著預測 14 個三陰性乳癌冷凍組織 ( TNBC Fresh-Frozen sample ) RNA-seq 數據中的 gene fusions 狀況,大約每個樣品可算出 302 個 gene fusions <span style="color: #ffa400;">( 圖1d )</span>。二重複再現率跟細胞株相似,僅有 8% 的 gene fusions 被 2 個以上的工具算出。作者團隊挑了 492 個 gene fusion 預測結果進行 qPCR 驗證,其中 2 個以上工具重複算出的 gene fusions 可驗證比例達 78-100%,高於細胞株數據 <span style="color: #ffa400;">( 圖1e )</span>。按可驗證度與預測數量推估,真實存在的 gene fusions 裡,可能 90% 只被單一工具所算出,僅 10% 會是多工具再現 <span style="color: #ffa400;">( 圖1f )</span>。結果顯示目前常用的 " 多分析工具交集 " 做法,對靈敏度影響很大。<br /><br />接著分析不同組織樣品中算出的 gene fusions,所有的 gene fusion 預測 ( n=2,772 ) 裡有 13% ( n=425 ) 在 2 個以上不同樣品被算出 <span style="color: #ffa400;">( 圖2a )</span>,而這 13% 的 gene fusions 裡,有 71% ( n=302 ) 的預測斷點具有 cis-near 特性 ( same chromosome, same strand, within 1 Mb ) <span style="color: #ffa400;">( 圖2b )</span>,這些 cis-near 特性 fusions 很可能是 read-through transcription 造成的相連基因融合 RNA 訊號。這些具有組織再現性的相連基因融合 RNA 預測結果,其 qPCR 驗證率跟整體差不多,不像是分析工具的偏差所造成。</div><div><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">4. 評估預測結果的 Tumor Specificity</span></b><br /><br />為了瞭解 gene fusion 預測結果的腫瘤特異性 ( tumor specificity ),作者團隊分析了來自 48 種不同的正常組織的 136 個不相關樣品 ( 包含了 4 個乳房樣品 ),顯示在不同乳癌樣品中重複算出的 gene fusions,與正常乳房組織算出的 gene fusions 具高度重疊,這些重疊出現的 gene fusions 預測有 74% 為 cis-near 特性 <span style="color: #ffa400;">( 圖2c )</span>。而不同乳癌樣品中重複算出、並具有 cis-near 特性的 gene fusions 預測有 39% 出現在正常乳房組織,而出現在其他正常組織的比例甚至達 49%。對比之下,trans-like gene fusions 的這兩個比例分別只有 1% 和 5%,顯示大部分的 cis-near gene fusions 預測,不是腫瘤特異性結果。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh4xBcLD5aL9iPh_Wd9vcz2y1K1wlTQwU82rsumjEiYqW_GkKQMYfg0bZZ-zR0fqlbG5h0agQQCMwbiojeMsHOQs0hPoxkhSV7_p0g02AH7ueNtDK1j4hANgv_OsV3qYZmZ51d1baqdZ6SxUHMUQjMaCvRw1Ikn4sLrbVflcQ9rGqG3cS1qgk41Uw7k/s988/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="988" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh4xBcLD5aL9iPh_Wd9vcz2y1K1wlTQwU82rsumjEiYqW_GkKQMYfg0bZZ-zR0fqlbG5h0agQQCMwbiojeMsHOQs0hPoxkhSV7_p0g02AH7ueNtDK1j4hANgv_OsV3qYZmZ51d1baqdZ6SxUHMUQjMaCvRw1Ikn4sLrbVflcQ9rGqG3cS1qgk41Uw7k/s16000/PIC_1.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><b>圖1 | Highly diverse GF prediction with different tools. </b><span style="color: #999999;"><b>a</b>, GFs (n = 2,361) were predicted with five prediction tools for the MCF7 breast cancer cell line from two sequencing replicates. <b>b</b>, The number of distinct predicted GFs (y axis) in MCF7 is shown for different combinations of tools (x axis) as indicated by dots below the bars. The fraction of GFs identified by one tool (orange) or multiple tools (green) is shown in the pie chart, and the percentage of GFs identified in two sequencing replicates (gray diagonal pattern) for one and multiple tool predictions is shown in the horizontal bar chart. <b>c</b>, 133 GFs were validated by RT–qPCR in MCF7 and SKBR3. Shown is the fraction of positive (blue) and negative (red) tested GFs according to the number of detecting tools and according to identification in one or both sequencing replicates. Labels at the top indicate number of tested GFs. <b>d</b>, Predicted GFs for 14 primary triple-negative breast cancer (TNBC) samples are shown (n = 4,488; one tool = orange, multiple tools = green). The pie chart shows the fraction of GFs predicted by one tool (orange) and multiple tools (green). <b>e</b>, 492 GFs were validated by RT–qPCR in 14 primary TNBC samples. Shown is the fraction of positive (blue) and negative (red) tested GFs according to the number of detecting tools. Labels at the top indicate the number of tested GFs. <b>f</b>, Considering the confirmation rate from RT–qPCR and the predicted number of GFs according to the number of predicting tools, the number of true-positive GFs was estimated (one tool = light blue, multiple tools = dark blue).</span></td></tr></tbody></table><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi7X67IUiwmXgmWNWkP2UeF_oqxCw93LLw7UWD-1THz7cEiEWKiXXes2FhbMPIYYAXWS6Rl2czS9qRk_BdW7SuctFmkRQdUAo6blrrxeyBwLk6OfO0TB9UkIWw_3waTYEntpNHtsq9HFv29Hggr8T_8R4w1rXnIKfkZeHuAzE0dGvxH8nZsPS_Xul7L/s800/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="248" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi7X67IUiwmXgmWNWkP2UeF_oqxCw93LLw7UWD-1THz7cEiEWKiXXes2FhbMPIYYAXWS6Rl2czS9qRk_BdW7SuctFmkRQdUAo6blrrxeyBwLk6OfO0TB9UkIWw_3waTYEntpNHtsq9HFv29Hggr8T_8R4w1rXnIKfkZeHuAzE0dGvxH8nZsPS_Xul7L/s16000/PIC_2.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><b>圖2 | Recurrent GFs are enriched for cis-near fusions in normal tissue.</b> <span style="color: #999999;"><b>a</b>, The frequency of recurrence is shown for distinct GFs in 14 TNBC samples (bar chart). The proportion of recurrently (dark gray) and uniquely (light gray) predicted GFs is also depicted (pie chart). <b>b</b>, Recurrent GFs are enriched for cis-near configuration. The number of recurrent and unique GFs is shown according to the configuration type of the breakpoints. 'cis' indicates GFs with breakpoints on same chromosome, 'trans' on different chromosome. 'inv' indicates breakpoints on different strands. 'cis-near' indicates GFs with breakpoints on the same chromosome and strand, within 1 Mb distance, whereas 'cis-far' indicates GFs with breakpoints farther apart. Percentages and total numbers of GFs are indicated. <b>c</b>, The overlap between recurrent (dark gray) and unique (light gray) predicted GFs in 14 TNBC samples with four normal breast tissue samples (green) is shown (Venn). The proportion of GFs in 'cis-near' configuration (green) for shared recurrent and unique GFs is shown (pie chart).</span></td></tr></tbody></table><div><br /></div><div><br /></div><div><div><b><span style="color: #6aa84f;">5. EasyFuse 改善 FFPE tumor-specific fusion 預測</span></b></div><div><br /></div><div>為了增進腫瘤特異性預測以及臨床 FFPE 樣品的適用度,作者團隊開發了 EasyFuse 演算法。該演算法最佳化 mapping 流程,並建立了一個機器學習篩選核心。Mapping 流程上加強 trans-like gene fusion 的分析力,針對 discordant read pairs ( >200 kb )、具有 soft-clip 的 split reads、unmapped reads 進行重點分析,並加強排除非腫瘤特異的 read-through transcription 資訊。首先輸入了 14 個不同癌種的臨床實際 FFPE 樣本 ( 腫瘤含量 20-90% ) 的二重複 SureSelect V6 FFPE RNA 定序數據 <span style="color: #ffa400;">( 圖4a )</span>,並以 qPCR 驗證這些 gene fusions 預測 <span style="color: #ffa400;">( 圖4b、c )</span>。接著挑其中 11 個樣品的數據及驗證結果來訓練 Random Forest 機器學習模型,餘下的 3 個樣品數據用於效能評估 <span style="color: #ffa400;">( 圖4b )</span>。作者團隊發現,EasyFuse 的機器學習模型評估資料中," 斷點類型 ( type ) "、" 斷點使用已知 exon 的剪切邊界 ( exon_boundary ) "、" 橫跨斷點的 read pair 數 ( ft_span ) " 三項資料擁有主要預測權重 <span style="color: #ffa400;">( 圖4d )</span>。另外,在二重複資料中都有被算出的 gene fusions,它們的預測分數也都高出許多。</div><div><br /></div><div>接著將 Arriba、先前用過的 5 個工具與 EasyFuse 一起分析 3 個效能評估用的臨床 FFPE 數據,EasyFuse 顯示出較好的陽性預測值 ( Positive Predictive Value,PPV )、靈敏度 ( Sensitivity ) <span style="color: #ffa400;">( 圖4g )</span>,對於 cis-near fusion、trans-like fusion 兩種類型的偵測,整體表現也都較好 <span style="color: #ffa400;">( 圖4h )</span>。</div></div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEj_qUyvScov-pQbaaM4cwiwMH5-pPZbTb7ZZzemWupXGTToo0vkZYUSMDuUUtWshsklMw7RThx6wrOC9Pd9kvt1UKa4OxObVNONkRqxYyZesEaLJ6FWdjHBOiMPF-3ATNVfoaL4JHqKuvms6jhetPGHDOsr3GnfGfPHidRg2Sa6E-2BfsangqLJ4tbz/s800/PIC_3.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="731" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEj_qUyvScov-pQbaaM4cwiwMH5-pPZbTb7ZZzemWupXGTToo0vkZYUSMDuUUtWshsklMw7RThx6wrOC9Pd9kvt1UKa4OxObVNONkRqxYyZesEaLJ6FWdjHBOiMPF-3ATNVfoaL4JHqKuvms6jhetPGHDOsr3GnfGfPHidRg2Sa6E-2BfsangqLJ4tbz/s16000/PIC_3.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><b>圖4 | Machine learning contributes to highly specific prediction of GFs in FFPE tumor samples.</b> <span style="color: #999999;"><b>a</b>, The number of predicted GFs (as unique breakpoint pairs) for 14 tumor samples. Breakpoint pairs that were identified in both replicates are shown in dark gray, whereas those found in single replicates are in light gray. The tumor type, histological tumor content of the sample and whether it is a primary (P) or metastasis (M) sample is indicated below. <b>b</b>, A total of 853 fusion breakpoints detected by EasyFuse across all samples were validated by RT–qPCR (positive in blue and negative in red); validation data were separated by samples into training and test datasets. <b>c</b>, The number and percent of GF breakpoints per sample detected in a single replicate or both replicates (top) as well as the number and percent of fusions validated positive (blue) or negative (red) in these subsets. <b>d</b>, Features used in the machine learning models. The heat map indicates which features (rows) are used in the different models (columns). The relative feature importance in the random forest model is shown. ft refers to the GF, and wt1 and wt2 refer to the corresponding wild-type variants. A more detailed description of all features can be found in Supplementary Table 10. <b>g</b>, Benchmark of fusion prediction performance between EasyFuse with the model 'EF_full' and six other tools on all validated fusions genes in the three test samples. PPV (top), sensitivity (middle) and F1 score (bottom) were calculated by weighting according to the concordance between tools as described in the Methods. <b>h</b>, Performance separately for GFs in cis-near (same chromosome and strand, less than 1 Mb distance) and trans-like configuration. The concordance bins were recalculated on the two subsets of fusions for weighted performance calculation.</span></td></tr></tbody></table><div><br /></div><div><br /></div><div><div><b><span style="color: #6aa84f;">6. Fusion neo-antigen 可應用於個人化的腫瘤免疫治療</span></b></div><div><br /></div><div>新生抗原 ( neo-antigen ) 為基因突變導致的異常蛋白質,可做為個人化抗癌疫苗的抗原。為了確認 gene fusions 作為腫瘤免疫治療標的效果,作者團隊以 EasyFuse 預測 14 個 FFPE 黑色素瘤 ( melanoma ) 樣本裡可能的 gene fusions,並挑高可能性 neo-antigen 進行自體 T 細胞免疫辨識能力測試。作者團隊先把 non-coding transcripts 以及非腫瘤源的 fusions 從所有的 gene fusions預測結果中濾掉 <span style="color: #ffa400;">( 圖5a )</span>,再將過濾後的 fusions 進行 HLA class I 或 class II 可匹配新生抗原決定位 ( neo-epitopes ) 計算 <span style="color: #ffa400;">( 圖5b )</span>。最後篩選出的 30 個高可能性 neo-antigens,以 IFN-γ ELISpot 測試患者 PBMCs 對這些 neo-antigens 的 CD4+ 或 CD8+ T 細胞反應性。這 30 個neo-antigens 中,有 10 個引發陽性 CD4+ T 細胞反應 <span style="color: #ffa400;">( 圖5c )</span>、1 個陽性 CD8+ T 細胞反應 <span style="color: #ffa400;">( 圖5c )</span>。免疫反應特異性部分,除了 PPP1R12C-CNN2 是對 wild-type peptide 會直接引起反應,其他都是由 novel peptides ( 不論是橫跨斷點或 out-of-frame ) 產生反應。有反應的 novel peptides 中,ZNF417-TSPAN11 同時產生了 CD4+ 及 CD8+ T 細胞反應,產生反應的是兩條跨斷點、互有重疊的 fusion peptides <span style="color: #ffa400;">( 圖5e )</span>。比對預測計算參數跟實際反應性,發現出現反應的結果皆為 neo-epitopes 預估 HLA 結合濃度 < 500nM 者 <span style="color: #ffa400;">( 圖5f )</span>,但與 fusion 的 RNA 定序 read 數量多寡未有明確關連。</div><div><br /></div></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiubQ4eR1L6660wF1vD4qkFo06waZKRx2pUZn9eGUsM41co2rxXKHEa61zkzyPpuczjr8AAMqnmZ6c4lKosmll5uDejDi2GwrIaDm47F7mlNjfhAYpYsKrp1CNGlQul_jqtrYAGKpr8vAmyuP_S3w1E1Hf-jfe1zXafz_HK_Ojx3KawNnSPqBsWvbPG/s800/PIC_4.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="684" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiubQ4eR1L6660wF1vD4qkFo06waZKRx2pUZn9eGUsM41co2rxXKHEa61zkzyPpuczjr8AAMqnmZ6c4lKosmll5uDejDi2GwrIaDm47F7mlNjfhAYpYsKrp1CNGlQul_jqtrYAGKpr8vAmyuP_S3w1E1Hf-jfe1zXafz_HK_Ojx3KawNnSPqBsWvbPG/s16000/PIC_4.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><b>圖5 | Predicted GFs encode immunogenic neo-antigens eliciting CD4+ and CD8+ T cell responses.</b> <span style="color: #999999;"><b>a</b>,The EasyFuse machine learning model predicted a median of 46 GFs in 14 patients with melanoma. <b>b</b>, Candidate filtering and epitope prediction resulted in a median of nine GFs per patient that encode at least one MHC class I or class II epitope. <b>c</b>, IFN-γ ELISpots after IVS were carried out for 30 selected fusion peptides with patient-derived PBMCs and resulted in CD4+ T cell responses for ten fusion peptides. CD4+ T cell reactivity against GF targets for PA-043, PA-045, PA-046, uID004 and uID018 (samples indicated by *) were not determined owing to high ELISpot background. <b>d</b>, Quantification of IFN-γ CD4+ T cell responses after IVS (11 days) and re-stimulation with iDCs pulsed with target pool peptides for the respective patient sample. iDCs loaded with irrelevant peptides served as control. Data are shown as background-corrected mean spot count. <b>e</b>, Post-IVS-measured CD4+ and CD8+ T cell response to target peptide-loaded iDCs exemplified for one patient (^ indicates predicted breakpoint position). <b>f</b>, Predicted binding affinity of GF-encoded neo-epitopes, which were tested for CD8+ T cell response (MHC class I) or CD4+ T cell response (MHC class II). Binding affinity is shown in nanomolar (nM) as predicted by netMHCpan for MHC class I epitopes and netMHCIIpan for MHC class II epitopes with patient-specific alleles. The dotted line indicates an affinity of 500 nM. Peptides without predicted epitopes are not shown.</span></td></tr></tbody></table><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgqNeJqTL0whiWXtjBJ5TPCGwWg-xT98lDr_sXK0sL0DbvdHzRmmb7-Xvp1Dzc41T9la4L3gK3eeBDM983S7_wbIVq3y6GcpZcEq1WuJi2Unmpvx95td7lx3Vpk1cjZ0QLox7KDYZLAPtyR0ute2gZLvk-3hcKctmAw1WJ5fEQwkS_dOY2HjaPx-R-z/s800/PIC_5.png" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="791" data-original-width="800" height="396" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgqNeJqTL0whiWXtjBJ5TPCGwWg-xT98lDr_sXK0sL0DbvdHzRmmb7-Xvp1Dzc41T9la4L3gK3eeBDM983S7_wbIVq3y6GcpZcEq1WuJi2Unmpvx95td7lx3Vpk1cjZ0QLox7KDYZLAPtyR0ute2gZLvk-3hcKctmAw1WJ5fEQwkS_dOY2HjaPx-R-z/w400-h396/PIC_5.png" width="400" /></a></div><div><br /></div>癌症研究、治療開發的速度一日千里,許多過去因技術限制忽略的資訊,皆用新一代技術突破並用於細胞治療、免疫治療。過去十年,SureSelect 技術協助科學界對腫瘤 DNA 突變更加的瞭解,建立泛癌腫突變數據庫。現在 SureSelect 可以讓您發現癌症 RNA fusions。不論以標準 whole exon,或是聚焦研究主題的 custom design,都能為您帶來可靠、有價值的研究結果,為不同的癌症,帶來新型治療的曙光。另外,過去您可能累積了許多的癌症 DNA 的突變資料,加入 gene fusions 後,能讓您的主題產生更高層次、更全觀的視野,為您奠定免疫治療、細胞治療的研究發展基礎。<div><br /></div><div><br /></div><div><br /></div><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span><br />1. <a href="https://www.nature.com/articles/s41587-022-01247-9" target="_blank">https://www.nature.com/articles/s41587-022-01247-9</a>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-55064579571858968802022-12-07T00:00:00.006-08:002023-01-09T21:43:41.927-08:00【SureSelect RNA Capture 應用介紹 - 3】復發性 RNA fusions 的存在,定義出瀰漫性胃癌 ( diffuse gastric cancer, DGC ) 預後最差族群<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiyepjTrzzZsNvN7znuV9Lz7OMxF3z-DtfN0z3HzBR2Mr9Lh57xdaNQ2UrEaefpzXXLQHMwCuW5z_RQTUBaqu0N0f71gmWBsBWt9ku2OR70v-Jeb_iO9wFfyRfYXlKBQheYds5rpFcp_0UXYT5II43YZbS-VOjBoASdAwNVmDN1VZtJRcETmviZOnOs/s800/BLOG.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="530" data-original-width="800" height="265" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiyepjTrzzZsNvN7znuV9Lz7OMxF3z-DtfN0z3HzBR2Mr9Lh57xdaNQ2UrEaefpzXXLQHMwCuW5z_RQTUBaqu0N0f71gmWBsBWt9ku2OR70v-Jeb_iO9wFfyRfYXlKBQheYds5rpFcp_0UXYT5II43YZbS-VOjBoASdAwNVmDN1VZtJRcETmviZOnOs/w400-h265/BLOG.jpg" width="400" /></a></div><div><br /></div>RNA fusion ( 融合基因 ) 的存在越來越被重視,一方面 RNA fusion 反應了癌症染色體上的結構變化,另一方面也增加了用藥的可能性。癌細胞的染色體中,常常出現如 Amplification、Deletion、Translocation、Structure Variation、LOH、MSI 等變異,這些變異的存在部分已有對應的預後、用藥指引。RNA fusion 源自於染色體結構變異,因此也成為潛在的可採取治療行動標的 ( actionable target ),若再進一步探討 fusion transcript 的 5' 端 partner gene 或 3' 端 partner gene 的序列,如存在訊息傳遞 / 調控功能區序列,則可以進一步探討可能的致病機制,以及研發調控對抗藥物。<br /><br />2018 年韓國國家癌症中心於 <i>Nature Communication</i> 上發表了一篇瀰漫性胃癌 ( diffuse gastric cancer, DGC ) 的 RNA fusion 成果 <span style="color: #ffa400;">( ref 1 )</span>。胃癌在韓國發生率為 12.5% ( 2020 年 IARC 數據 ),除了是韓國發生率最高的癌種外,也是全世界胃癌發生率最高的地區。胃癌依組織分有腸型 ( intestinal-type ) 及瀰漫性 ( diffuse-type ) 兩種。除了組織差異外,兩種胃癌在幽門螺旋桿菌 ( H. pylori ) 致癌性流行病學 ( epidemiology of carcinogenesis ) 上也有所差異 <span style="color: #ffa400;">( ref 2 )</span>,但過往的胃癌研究多以腸型為主,並以腸型胃癌的認知套用於瀰漫性胃癌,因此韓國國家癌症中心投入瀰漫性胃癌的分子機制與預後指標研究。<br /><br />韓國國家癌症中心團隊先前以 DNA 層次出發,分析 80 位 DGC 患者的 SureSelect WES 數據,發現早發性 DGC ( <45 years ) 較一般 DGC ( 50–70 years ) 高出 24.8% 的 CDH1 癌症突變率 <span style="color: #ffa400;">( ref 3 )</span>,帶有 CDH1 癌症突變也有高機會發展成惡性的 HDGC ( hereditary diffuse gastric cancer )。此次研究延伸入 RNA 層次,找到與預後高度相關的 RhoGAP domain-containing fusions 及 PPAPDC1A fusions. 以下是韓國國家癌症中心以 225 人的高品質檢體,搭配 SureSelect RNA Capture Panel 進行 target RNA sequencing,找出 DGC 發生率及預後關聯性高的 RNA fusions 摘要內容:<br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">1. 25 個功能相關的 in-frame RNA fusions</span></b><div><br />研究團隊為了篩選出高可靠度的 fusion candidates,由具有完整臨床資料 ( 包含 MSI、EBV 測試 ) 的 80 位未經化 / 放療的早發性 DGC ( ≤ 45歲 ) 韓國患者,取得腫瘤、周邊正常組織的冷凍樣本,每個案例使用 1-2 ug 高品質 RNA 進行 polyA RNA-seq 定序以及 RNA fusion 預測分析,再以 RT-PCR 驗證 in-frame fusion candidates,最後確認有 25 個 in-frame RNA fusions <span style="color: #ffa400;">( Figure 1b、1c )</span> 存在。這 25 個 fusions 有 1 個在 TCGA 胃癌數據庫中出現 <i>( CLDN18-ARHGAP26 )</i>;而 24 個 RNA fusions 未曾於已知胃癌研究中發現。這 24 個未曾發現的 RNA fusions,其中有 8 個 fusions 的 5' 端或 3' 端 fusion partner 曾出現於 TCGA 胃癌數據中,以及 1 個未與胃癌關聯但為臨床已知的 EML4-ALK。全部 25 個 RNA fusions 的 3' 端 partner gene 多具有高度表現,如 EML4-ALK fusion 的 ALK 部分、UBE2L3-MAPK1 fusion 的 MAPK1 部分 <span style="color: #ffa400;">( Figure 1a )</span>。分析這 25 個 fusion 的 3' 端 partner gene 的基因功能,發現與 Rho GTPase pathway 顯著相關 ( P = 0.01 ),Rho GTPase pathway 與細胞型態、存活、增生與黏著相關,暗示 gene fusions 可能造成了相關影響。<br /><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjKnd1bYHGMrrW8IYFyNOqYhhZQxkbev_F1Lere67g7m5qMOybT5S0QBuFW0573LJpdIvtssUSa1xy6KK9vaeztgqPBa2grK23Y8rO5f8ZdW3g1g9ryJLJOrWb9uszwVK6pTHHXD1MEWmYuGWiTGkvmu8Nc1B3DN7wW_m0fVt_qEp677icanIgHHWu8/s1366/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="1366" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjKnd1bYHGMrrW8IYFyNOqYhhZQxkbev_F1Lere67g7m5qMOybT5S0QBuFW0573LJpdIvtssUSa1xy6KK9vaeztgqPBa2grK23Y8rO5f8ZdW3g1g9ryJLJOrWb9uszwVK6pTHHXD1MEWmYuGWiTGkvmu8Nc1B3DN7wW_m0fVt_qEp677icanIgHHWu8/s16000/PIC_1.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><div style="text-align: left;"><b>Figure 1|Twenty-five in-frame gene fusions identified in a discovery dataset of 80 early-onset DGCs</b></div><span style="color: #999999;"><div style="text-align: left;">(a) Top panel, Expression level of ALK in the tumor containing the EML4-ALK fusion (magenta circle). Each circle represents each tumor. Sample ordering according to ALK expression level. Bottom panel, Expression level of MAPK1 in the tumor containing the UBE2L3-MAPK1 fusion (magenta circle). Sample ordering according to MAPK1 expression level. (b) Circos plot for the 25 in-frame fusions. (c) Exon-level, Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped (FPKM) values for the in-frame gene fusions. Heatmap after gene centering. Dotted lines, mRNA breakpoints; Red, higher expression level; Blue, lower expression level. In a majority of fusions, 3' partner genes overexpressed exons that were located 3' to the break points.</div></span></td></tr></tbody></table><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">2. 帶有 RhoGAP domain 的三個復發性 in-frame fusion</span></b><br /><br />為了更全面評估這 25 個 RNA fusions 在不同類型 DGC 中的臨床或生物意義,因此將樣本族群由 80 人擴增至 384 人,包括了 249 位晚發性 DGC 的老年 ( ≥ 46歲 ) 患者,以 RT-PCR 測試所有樣品中這 25 個 RNA fusions 的表現狀況。有 3 個 RNA fusions,CLDN18-ARHGAP26、CTNND1-ARHGAP26、ANXA2-MYO9A <span style="color: #ffa400;">( Figure 2 )</span>,具有復發性 ( recurrent, present in ≥ 2 samples )。這 3 個 RNA fusions 的 3' 端 partner gene 皆有 RhoGAP domain,在 4.4% ( 17 in 384 ) 的腫瘤樣品中可以偵測出,並且對應的周邊正常組織中未被檢出,暗示他們的出現代表了腫瘤變異。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgiYnqhLVV_dYDzbMJgDU3jdiW6pphtKJDwkwjwuYnchO8T9QZFitwbP7fk7OAOgPTS0G2n7Qa-sV5NRUHGAA3htiUbPEse17v6Y1Lnr8lpmiM26ht6GBN_9RTl-LHRZYyC07VjhQyCAIV7xV-mKwl7gyFgADv6kSKT0Zkg0KrCKPV_VYK91RuDM81t/s800/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="350" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgiYnqhLVV_dYDzbMJgDU3jdiW6pphtKJDwkwjwuYnchO8T9QZFitwbP7fk7OAOgPTS0G2n7Qa-sV5NRUHGAA3htiUbPEse17v6Y1Lnr8lpmiM26ht6GBN_9RTl-LHRZYyC07VjhQyCAIV7xV-mKwl7gyFgADv6kSKT0Zkg0KrCKPV_VYK91RuDM81t/s16000/PIC_2.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;"><b>Figure 2|Schematic representation of three recurrent RhoGAP domain-containing fusions</b><br /><span style="color: #999999;">(a) Chromatogram for the RT-PCR sequencing data. Dotted red lines, mRNA breakpoints. (b) Top panel, the CLDN18-ARHGAP26 fusion. Middle panel, the CTNND1-ARHGAP26 fusion was composed of the Armadillo (Arm) family domain of CTNND1 that is involved in cell-cell adhesion and signal transduction and RhoGAP and SH3 domains of ARHGAP26. Bottom panel, the ANXA2-MYO9A fusion was composed of 99 amino acids in the N-terminal portion of ANXA2 and the protein kinase C conserved region 1 (C1) and RhoGAP domain of MYO9A.</span></td></tr></tbody></table><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">3. RhoGAP domain fusion 的臨床關聯性</span></b><br /><br />17 個具有 RhoGAP domain fusion 的 DGC 案例只有 1 例是 Microsatellite unstable tumor 且都為 EBV-negative,以性別、腫瘤位置、TCGA 分子分群來分析,RhoGAP domain fusions 的存在未見到顯著的分群差異。<br /><br />由預後狀況來進一步分析,發現 RhoGAP domain fusions 的 DGC 案例 ( n = 17, median survival: 29.1 month ) 的預後明顯低於 ( P = 0.011 ) 無此類融合的患者 ( n = 367, median survival: 94.6 month ) <span style="color: #ffa400;">( Figure 4a )</span>;有 RhoGAP domain fusion 患者的遠端轉移發生率似乎較高 ( P = 0.15 ) 於沒有此融合的患者。其中 CLDN18-ARHGAP26 為出現率最高的 RhoGAP domain fusions ( 13 in 17 ),僅此 fusion 的有無即可獲得相似的預後狀態區分,突顯了 CLDN18-ARHGAP26 的 DGC 預後臨床關聯性 <span style="color: #ffa400;">( Figure 4b )</span>。<div></div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiNDqOjqTZ5e7rZNdOu-rqnfwOZOiru5N3FDrxj9TZfBQUHf6o6DNUlUiiqPcNYuXnZeK_KuxmrAkoDkKJNqaEaKPJzGGzYxttwnOFhLXotUX8jP_KVCIaIG1oBbGHxLHYZ_Xwo2aakb5K0KTsdED-PWrJoElh38RjvJVRSY5MHmW4FcXOYOT-PGZAC/s1475/PIC_3.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="1475" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiNDqOjqTZ5e7rZNdOu-rqnfwOZOiru5N3FDrxj9TZfBQUHf6o6DNUlUiiqPcNYuXnZeK_KuxmrAkoDkKJNqaEaKPJzGGzYxttwnOFhLXotUX8jP_KVCIaIG1oBbGHxLHYZ_Xwo2aakb5K0KTsdED-PWrJoElh38RjvJVRSY5MHmW4FcXOYOT-PGZAC/s16000/PIC_3.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;"><b>Figure 4|Clinical implications of RhoGAP domain-containing fusions in the expanded dataset (n = 384)</b><br /><span style="color: #999999;">(a) Clinicopathological characteristics (gender and primary tumor location) and TCGA subgroups in patients with (upper row) and without (lower row) RhoGAP domain-containing fusions. (b) Kaplan-Meier curves for the overall survival of patients with DGCs expressing three recurrent RhoGAP domain-containing fusions (n = 17) and those without (n = 367). (c) Kaplan-Meier curves for the overall survival of patients with DGCs expressing the CLDN18-ARHGAP26 fusion (n = 13) and those without (n = 371)</span></td></tr></tbody></table><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">4. SureSelect 抓出另一個復發性 fusion, TACC2-PPAPDC1A</span></b><br /><br />為了盡可能找出 DGC 樣品中跟 25 個 in-frame fusions 有關的 RNA fusion 變異,以 SureSelect RNA Capture 技術,將參與 fusions 組成的 48 個基因的 exons 設計成 custom panel,進行 target RNA sequencing。此方式找到了與先前融合斷點 <span style="color: #ffa400;">( Table 1 )</span> 不同的新fusions <span style="color: #ffa400;">( Table 2 )</span>,並多找出了三個預後關聯性高的 CLDN18-ARHGAP26 fusions,其中 2 個斷點也與之前不同。更重要的,這個方法鑑定出 TACC2-PPAPDC1A fusion 也具有復發性,佔了 DGC 腫瘤樣品的 1% ( 3 of 305 ),這是該 fusion 第一次在人類腫瘤樣品中報導其復發性。新發現的 TACC2-PPAPDC1A fusion 斷點與先前不同 <span style="color: #ffa400;">( Figure 6a )</span>,並且未出現於周邊正常組織檢出,該 fusion 顯示出腫瘤特有的變異特色。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEitX3ckoV2DNcrdDIs151TbiAkY89cffhuYL8eYAdjPfeAiIvX0J7ouOOVcZg3cinATk7Yiw5GxbYTAIoaL_5M3EYkZ2vcE0Q7JHG7aY2jB5aBkrT5AFFdgbKpUcYSgA-Mbz2adlOL7QGWdesmikXiyJAZMlZEG-2vGc_aWzi83h2U73uQlXG8QmBAD/s825/PIC_4.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="825" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEitX3ckoV2DNcrdDIs151TbiAkY89cffhuYL8eYAdjPfeAiIvX0J7ouOOVcZg3cinATk7Yiw5GxbYTAIoaL_5M3EYkZ2vcE0Q7JHG7aY2jB5aBkrT5AFFdgbKpUcYSgA-Mbz2adlOL7QGWdesmikXiyJAZMlZEG-2vGc_aWzi83h2U73uQlXG8QmBAD/s16000/PIC_4.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;"><b>Table 1|In-frame fusions in a discovery set (n = 80)</b></td></tr></tbody></table><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhfKPCoLmj-PnIq1h2JdQcJHw2kiCl31ZF6rg3SZA7yw428Q7CJ0fJ2tbOJw7Kkskdtauo18xc-M143DwiynqbY6gvxII3I9SIEiikV3GyvevV-Em2LpVfKypF2yvrQ6HcBFwrk7W4BDovPg2DrH5CLMew0wz2aOUdsrg81BBa-PJb7N-_XBfWuvJeE/s800/PIC_5.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="526" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhfKPCoLmj-PnIq1h2JdQcJHw2kiCl31ZF6rg3SZA7yw428Q7CJ0fJ2tbOJw7Kkskdtauo18xc-M143DwiynqbY6gvxII3I9SIEiikV3GyvevV-Em2LpVfKypF2yvrQ6HcBFwrk7W4BDovPg2DrH5CLMew0wz2aOUdsrg81BBa-PJb7N-_XBfWuvJeE/s16000/PIC_5.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;"><b>Table 2|In-frame gene fusions additionally identified by targeted RNA sequencing analysis</b></td></tr></tbody></table><br /><table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align: center;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiRIdCoNsfs68oLYUQdFQarCv3PVogMyADi_KxDlsKSFEgacIxwXdQKjNJbMPXzQ_ipGu38z2c6A_7waS5pq0HfQ_6Mh7YhkPeQ7CSygaDYVaN-WsiA894QPKtFvZIlyA485wNSMrxy7189UE24irA3QEeOzHeE0I6eiQyHK-dLxKbSDGT30mE21tpe/s982/PIC_6.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="982" data-original-width="799" height="640" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiRIdCoNsfs68oLYUQdFQarCv3PVogMyADi_KxDlsKSFEgacIxwXdQKjNJbMPXzQ_ipGu38z2c6A_7waS5pq0HfQ_6Mh7YhkPeQ7CSygaDYVaN-WsiA894QPKtFvZIlyA485wNSMrxy7189UE24irA3QEeOzHeE0I6eiQyHK-dLxKbSDGT30mE21tpe/w520-h640/PIC_6.jpg" width="520" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;"><b>Figure 6|The PPAPDC1A in-frame fusions identified by targeted RNA sequencing</b><br /><span style="color: #999999;">(a) Schematic representation of the PPAPDC1A fusions. Top and middle panels, TACC2-PPAPDC1A fusions; Bottom panel, ARIH1-PPAPDC1A. CC, Coiled-coil domain; PAP2, PAP2 domain; ZF, Zinc finger domain.</span></td></tr></tbody></table><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">5. 復發性 fusions 的存在,比其他基因指標更能定義出預後最差的群體</span></b><br /><br />根據該研究團隊的已知最大規模的瀰漫性胃癌 ( DGC ) 群體,復發性 fusions、PPAPDC1A 或 RhoGAP domain fusions 的存在,與預後最差群體有極顯著的關聯性,皆達到 p< 0.0001 <span style="color: #ffa400;">( Table 3 )</span>。相較之下,以 SNP 晶片做的染色體不穩定性分析 ( chromosomal instability, CIN ) 或先前發現預後相關的 CDH1 突變,顯著程度都不如復發性 fusions。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi5CywSlN4arZgszrtSR78dXL-4e9mPa3LlhozqTcZWdpcm2Na5Xi-TGuwwSefSk9i38b9uOJyPjWxlGPcH7S2GOqdA2RXL5otCNakwieH7gmWQR_Ap3ivrXQwYnx_r9R-rnokzxiAb4hZ7b21hdN8kGvS8AF1MD2TG-76BtUj02aT-gJUMzxW_1Qfw/s800/PIC_7.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="447" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi5CywSlN4arZgszrtSR78dXL-4e9mPa3LlhozqTcZWdpcm2Na5Xi-TGuwwSefSk9i38b9uOJyPjWxlGPcH7S2GOqdA2RXL5otCNakwieH7gmWQR_Ap3ivrXQwYnx_r9R-rnokzxiAb4hZ7b21hdN8kGvS8AF1MD2TG-76BtUj02aT-gJUMzxW_1Qfw/s16000/PIC_7.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;"><b>Table 3 Cox regression survival analysis of 173 DGCs with available SNP6.0 array and DNA sequencing data</b></td></tr></tbody></table><br /><br />RNA fusion 為癌症研究新興且重要的 biomarker,瞭解它在癌症及生物機制上的角色也越來越重要。SureSelect RNA Capture Panel 可以設計出針對主題的客製化癌症 fusion 內容,讓您以高敏度方式,找出前人研究所遺漏的關鍵 RNA fusions,成為您未來癌症檢測開發或臨床應用上的重要技術。<br /><br /><br /><br /><span style="color: #ffa400;">【References】</span><br />1. Yang, H., Hong, D., Cho, S. Y., Park, Y. S., Ko, W. R., Kim, J. H., Hur, H., Lee, J., Kim, S. J., Kwon, S. Y., Lee, J. H., Park, D. Y., Song, K. S., Chang, H., Ryu, M. H., Cho, K. S., Kang, J. W., Kook, M. C., Thiessen, N., He, A., … Kim, H. K. (2018). RhoGAP domain-containing fusions and PPAPDC1A fusions are recurrent and prognostic in diffuse gastric cancer. <i>Nature communications, 9(1)</i>, 4439.<div><br />2. Assumpção, P. P., Barra, W. F., Ishak, G., Coelho, L., Coimbra, F., Freitas, H. C., Dias-Neto, E., Camargo, M. C., & Szklo, M. (2020). The diffuse-type gastric cancer epidemiology enigma. BMC gastroenterology, 20(1), 223.<br /><br />3. Cho, S. Y., Park, J. W., Liu, Y., Park, Y. S., Kim, J. H., Yang, H., Um, H., Ko, W. R., Lee, B. I., Kwon, S. Y., Ryu, S. W., Kwon, C. H., Park, D. Y., Lee, J. H., Lee, S. I., Song, K. S., Hur, H., Han, S. U., Chang, H., Kim, S. J., … Kim, H. K. (2017). Sporadic Early-Onset Diffuse Gastric Cancers Have High Frequency of Somatic CDH1 Alterations, but Low Frequency of Somatic RHOA Mutations Compared With Late-Onset Cancers. <i>Gastroenterology, 153(2),</i> 536–549.e26.</div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-34738609780144948172022-11-08T18:24:00.001-08:002022-11-14T16:50:25.598-08:00【SureSelect WES 應用 - 3】SureSelect WES 協助 AML RNA 基因檢測開發<div class="separator" style="clear: both;"><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgxz1LCjdilWLg_zXZcdybYqmLttp2RVwwIKyWiRRslPJrzOsAgd1cwnlb9DZA-qY0JbE7KjyZn2TGzX1BqWleP-jnctGVPUAwoDOjrip1baD7lgI9ypZCGRVRAhuNGaMON_lgHlDh8jucRuDu3J1JLcBMm74Isdtkqee6UECWmwiDAWunF6E7DbFVN/s800/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="465" data-original-width="800" height="233" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgxz1LCjdilWLg_zXZcdybYqmLttp2RVwwIKyWiRRslPJrzOsAgd1cwnlb9DZA-qY0JbE7KjyZn2TGzX1BqWleP-jnctGVPUAwoDOjrip1baD7lgI9ypZCGRVRAhuNGaMON_lgHlDh8jucRuDu3J1JLcBMm74Isdtkqee6UECWmwiDAWunF6E7DbFVN/w400-h233/PIC_1.jpg" width="400" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><span style="color: #3d85c6;">SureSelect Human Exome</span></td></tr></tbody></table><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><br /></div>急性骨髓性白血病 ( Acute Myeloid Leukemia, AML ) 可能的基因變異涵蓋了點突變 ( point mutation )、小片段插入缺失 ( small INDEL ) 與基因融合 ( gene fusion )。理論上藉由檢測 RNA 能獲得比 DNA 更完整的資訊,但開發檢測法時需要進行跨 RNA、DNA 比對,以評估 RNA 檢測在既有突變標的上的效力。</div><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both;">文獻同時使用了 WES 與 WGS 作為 DNA 驗證方法,對比之下,WES 偵測出更多與 RNA 一致的變異 ( SNV )。WES 有效涵蓋影響基因表現的關鍵區域,將定序數據集中於已知重要的功能基因中。顯示新檢測開發驗證時,WES 會是兼顧廣泛性與靈敏度的適合工具。</div><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiue2qhtfLqHxSxdWkeIV9XR4dKOsv8_HXB7I9iHbTAWEAnw0rwQKfwEGspKb8fM5qRYO-y3I8Eb2OKzIS-SjotCGJhy0X7BVhtQ4xQqY22D0NsmW6yh_Vr3M1kKY84GyWlkZcbNvBOcLPc2JppV-ZabsC8N3Pfg4VliQapDy2UUPTHkBI2SIjbuYfX/s800/PIC_2.jpg" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="271" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiue2qhtfLqHxSxdWkeIV9XR4dKOsv8_HXB7I9iHbTAWEAnw0rwQKfwEGspKb8fM5qRYO-y3I8Eb2OKzIS-SjotCGJhy0X7BVhtQ4xQqY22D0NsmW6yh_Vr3M1kKY84GyWlkZcbNvBOcLPc2JppV-ZabsC8N3Pfg4VliQapDy2UUPTHkBI2SIjbuYfX/s16000/PIC_2.jpg" /></a></div><div><br /></div><div style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhXchla5cPbNlewB2Ycchknq0h0D_nkF4QiqHPx_aE-SVdTr56NyNo4_f6NAIE90_L08S3-n9WU9MWaUG-yQd1ncy4NTL040XNoKzv3Tl9NRiPv7vq8E-ZgbcGDsRs2aIAueR5X1J3sS0x46RbD4s0AeFkfstjQqSmNMJCiXJhNOnIPm-fDJjncYPCl/s800/PIC_3.jpg"><img border="0" data-original-height="246" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhXchla5cPbNlewB2Ycchknq0h0D_nkF4QiqHPx_aE-SVdTr56NyNo4_f6NAIE90_L08S3-n9WU9MWaUG-yQd1ncy4NTL040XNoKzv3Tl9NRiPv7vq8E-ZgbcGDsRs2aIAueR5X1J3sS0x46RbD4s0AeFkfstjQqSmNMJCiXJhNOnIPm-fDJjncYPCl/s16000/PIC_3.jpg" /></a></div><div style="text-align: right;"><a href="https://www.nature.com/ncomms/" target="_blank"><i>Nature Communications</i></a></div><div><div style="text-align: right;"><b>volume 12</b>, 2474 (2021)</div><div style="text-align: left;"><i>Figure 1. Experimental overview and short nucleotide variant/indel analysis.</i></div><div><br /></div></div><div><br /></div><div><br /></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-6914919147155544792022-10-18T00:00:00.001-07:002022-10-18T18:47:30.343-07:00【SureSelect WES 應用 - 2】SureSelect 協助尋找病毒感染後的 exon 突變<div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEg5ySfkh9tjgY7WX6OB1jYeA_WHTDx8Hvx5OGhx4771gvS-quGAgZcXFf4NuntMBBWKX07Hxcn751-F2n4PeZDFMijnSvcm-O9UAUCTqQBmq6h183oBkvD7-o0QeuD9xtX5t_j6-vz_h7P2oTVgQpRDNPMPak3YJf_4TdU-BuexB9KmB2MqPov0Dzjt/s800/PIC_1.png" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="791" data-original-width="800" height="316" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEg5ySfkh9tjgY7WX6OB1jYeA_WHTDx8Hvx5OGhx4771gvS-quGAgZcXFf4NuntMBBWKX07Hxcn751-F2n4PeZDFMijnSvcm-O9UAUCTqQBmq6h183oBkvD7-o0QeuD9xtX5t_j6-vz_h7P2oTVgQpRDNPMPak3YJf_4TdU-BuexB9KmB2MqPov0Dzjt/w320-h316/PIC_1.png" width="320" /></a></div></div><div><b style="background-color: #eeeeee;"><br /></b></div><b style="background-color: #eeeeee;">T細胞淋巴瘤 STAT3基因的罕見突變位 ( DNA binding domain )</b><br /><br />利用 SureSelect 分析 HIV-1 原病毒感染後的 T 細胞淋巴瘤,發現 STAT3 基因的 DNA binding domain 存在 3 個胺基酸 ( VIK ) 插入的 insertion,暗示可能的上調控機制。<div><br /></div><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgmJMkxelOQiLAW41KizFxvYhpWTITsVhuahvA95rgGoL5bp53Me9oxPruiPBkZsnpByOVKmEvX3aGbmWIddNAQQv78M4R_FnRJVSj2VGvhY2FVccfUvCbEsnvPm82hljYboRa3PuYbpTLqARDYn1oBUzZNJQFgszSYy7HHEvc730jSWXryvjRVc-3F/s800/PIC_2.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="226" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgmJMkxelOQiLAW41KizFxvYhpWTITsVhuahvA95rgGoL5bp53Me9oxPruiPBkZsnpByOVKmEvX3aGbmWIddNAQQv78M4R_FnRJVSj2VGvhY2FVccfUvCbEsnvPm82hljYboRa3PuYbpTLqARDYn1oBUzZNJQFgszSYy7HHEvc730jSWXryvjRVc-3F/s16000/PIC_2.jpg" /></a></div> <a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8514100/">Sci Adv.</a> 2021 Oct; 7(42): eabi8795.<div><br /></div><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjwvHh0YpjaiOzyzKQi-C4bATWo4RcHE70tRwEMQLwqANzzG0el2KrQ-Pv8UOWtowHDuTRlRyU97N1U7I24TpweATmCBo8RPt05tu8ffNNLLRdgLTS4K95LAPhI3btq2Zpc4Y-wf5_yQgYlfOgllD3LzMXGDx4qGiTTUg2bkmPY1frXAZQw4w5vs213/s800/PIC_3.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="442" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjwvHh0YpjaiOzyzKQi-C4bATWo4RcHE70tRwEMQLwqANzzG0el2KrQ-Pv8UOWtowHDuTRlRyU97N1U7I24TpweATmCBo8RPt05tu8ffNNLLRdgLTS4K95LAPhI3btq2Zpc4Y-wf5_yQgYlfOgllD3LzMXGDx4qGiTTUg2bkmPY1frXAZQw4w5vs213/s16000/PIC_3.jpg" /></a><br /><br /><b>Figure S5.</b> In lymphoma sample 1A, there is a 9 nucleotide insertion in the STAT3 gene in the allele that is activated by an HIV provirus. Panel A. The 9 nucleotide insertion leads to a three amino acid insertion in the portion of STAT3 that encodes the DNA binding domain. Panel B. The diagram shows the two forms of the STAT3 protein, and their domains. The position of the VIK insertion is marked with an arrow, as are the sites where the proteins are phosphorylated.</div><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-6650867599016940192022-09-28T00:30:00.002-07:002023-01-09T21:44:29.654-08:00【SureSelect RNA Capture 應用介紹 - 2】星形母細胞腦腫瘤的 WES 分析<div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEj-y6EH5oEZLSXs61qP6LXk2ncLEra_eIWLCyrOmqnC6GBjnM5SkWukp6gJHoKKX3qP4-91McqTXuYYM-3djenUgHKBgQ8iDPPQCj9D9DqZ7BE5j81ebWcmFEwX2n0UxTXtrRLOoPewlktT_dhV6yN-1ZQMuWgKslJ-cJYGHDDpPUe5NnuACUGrAMwh/s814/BLOG.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="814" data-original-width="800" height="320" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEj-y6EH5oEZLSXs61qP6LXk2ncLEra_eIWLCyrOmqnC6GBjnM5SkWukp6gJHoKKX3qP4-91McqTXuYYM-3djenUgHKBgQ8iDPPQCj9D9DqZ7BE5j81ebWcmFEwX2n0UxTXtrRLOoPewlktT_dhV6yN-1ZQMuWgKslJ-cJYGHDDpPUe5NnuACUGrAMwh/s320/BLOG.jpg" width="314" /></a></div><br /></div>2014 年,美國國家癌症研究所 ( National Cancer Institute ) 發起癌症基因體圖譜計畫 ( The Cancer Genome Atlas, TCGA ),進行超過 20 種癌症的基因研究,全外顯子分析 ( Whole Exome Sequencing, WES ) 促成且提供了功能基因致癌及影響癌症發展的分子訊息,也發現癌症成因比想像還更為複雜,可來自許多不同類型的基因突變 ( 如:Insertion、Deletion、Translocation、Inversion、Fusion… ),也可能涉及多處突變同時發生。<div><br />基因融合 ( gene fusion ) 是癌症中一類重要的基因病變,在腫瘤發生的初期即發揮重要作用,約佔人類罹癌發病的 20%,相對於其他突變類型的研究,卻沒有足夠豐富的資料,加上融合基因發生在各個癌症/病況之間的差異很大,外顯子分析可就基因編碼區域做掃描,快速找到多個 fusion 位點,對於未知新穎、待研究的罕見癌症,確可助於有效歸納、累積癌症 gene fusion 資料。</div><div><br />2022 年路易斯維爾大學布朗癌症中心 ( University of Louisville / James Graham Brown Cancer Center ) 在 <i>Nature Communications</i> 期刊上發表了星形芽細胞瘤 ( Astroblastomas, ABs ) 的基因研究,ABs 為一種罕見、起源不明的上皮性腦腫瘤,通常發生在年輕人和兒童,女性居多。目前知道 ABs 至少有兩種基因型,分別是 BRAF V600E 突變型與 MN1 基因重組型,其中 MN1 基因重組型的腫瘤被報告過存在 MN1-BEND2 融合基因。</div><div><br />布朗癌症中心收集了 24 例類 AB 腦瘤 ( AB-like tumors, 6例 BRAF V600E, 6例 MN1-重組, 12例不具有 BRAF V600E 或 MN1-重組 ),及 7 例的天幕上室管膜瘤 ( supratentorial ependymoma, STE ) 或松果體乳頭狀瘤 ( papillary tumor of the pineal region, PTPR ) 樣品,進行 Agilent SureSelect RNA exome。</div><div><br /></div><div><br /><span style="color: #6aa84f;"><b>AB-like tumor 的 RNA exome 分析</b></span></div><div><br />為了同時掌握腫瘤基因表現狀況並偵測任何可能的基因突變,透過 SureSelect 外顯子系統配合 RNA 分析後,31 個樣品資料經比對,快速找出了 1793 個重要突變及基因變化 <span style="color: #ffa400;">( Fig 1c、Fig 2 )</span>,發現與腦腫瘤相關的特定基因過表現狀況 ( overexpression )、RNA fusion、Indel 突變等等的基因異常現象 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2 )</span>。</div><div><br />並且,研究發現女性患者的 AB-like 腫瘤中,與 X 染色體相關的融合基因出現率高達 5 倍多 <span style="color: #ffa400;">( Tab 2 )</span>,幾乎在 MN1-BEND2 融合型及 BRAFV600E 突變型的癌症樣品中都有發現,而女性患者的 22 號染色體融合發生率更高。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh2e4ge0YB-VPXCGP9WkZDE0uhPKG0dg4how1W4tF1KGFB7P-fiV1xr6aOQ41vQpLt6_l7krTFjVIxg976GmA4I471dk74vTaoT0IEc2P64KHKomvVqKq8pU40aSSbCEpd9uQTFIln-vaoW73Fr66pktgaFCjjnsPH_W3u3zCBJRkiud9BcwiX5cW-Z/s1198/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="1198" data-original-width="800" height="640" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh2e4ge0YB-VPXCGP9WkZDE0uhPKG0dg4how1W4tF1KGFB7P-fiV1xr6aOQ41vQpLt6_l7krTFjVIxg976GmA4I471dk74vTaoT0IEc2P64KHKomvVqKq8pU40aSSbCEpd9uQTFIln-vaoW73Fr66pktgaFCjjnsPH_W3u3zCBJRkiud9BcwiX5cW-Z/w427-h640/PIC_1.jpg" width="427" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><div style="text-align: left;"><b>Figure 1c. Astroblastoma and neural stem/progenitor cell morphologies and AB-like tumor molecular subtypes.</b></div><div style="text-align: left;"><span style="color: #999999;">Unsupervised hierarchical clustering of RNAseq expression data separates AB-like tumors into <i>MN1-</i>rearranged and MAPK/PI3K pathway transcriptomic groups. Genes overexpressed in <i>MN1-BEND2</i> tumors are highlighted in red, those overexpressed in MAPK-ABC tumors in blue and PTPR in bronze. Some genes highly expressed in both <i>MN1-BEND2</i> tumors and PTPR are depicted in red.</span></div></td></tr></tbody></table><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjADTuuBhEr_idkcnfV6sCwNswRbJ7CleexDnrtw2d4lilWOBydimWjA0L6VdB2MzS43baWiMlf-IBW9ApcazloF5XnqrqvGVVqf-4to_wgUGnOGuGTDXUAZDUOaYSUqtZzKV3dPQHkkMAYaQWEf4mSFsd-E97l6hv1i0QO3MvWQ5jMmXL_H_wXFofq/s1203/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="1203" data-original-width="800" height="640" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjADTuuBhEr_idkcnfV6sCwNswRbJ7CleexDnrtw2d4lilWOBydimWjA0L6VdB2MzS43baWiMlf-IBW9ApcazloF5XnqrqvGVVqf-4to_wgUGnOGuGTDXUAZDUOaYSUqtZzKV3dPQHkkMAYaQWEf4mSFsd-E97l6hv1i0QO3MvWQ5jMmXL_H_wXFofq/w426-h640/PIC_2.jpg" width="426" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><div style="text-align: left;"><b>Figure 2. Gene mutations and fusions segregate AB-like tumor genetic groups.</b></div><div style="text-align: left;"><span style="color: #999999;">Pathway gene alterations across AB-like tumors, ATAB, PTPR and RELA STE are grouped. Missense = MS, splice region variant = SV, stop gained = SG, stop lost = SL, frameshift = FS, deletion = DEL, insertion = INS, fusion = FU, PT = PTPR. Detected genetic alterations are highlighted in red. Brown cells indicate fusions detected by only one read. Pink indicates a FathmmMLK score <0.5, but predicted to be damaging by PolyPhen or deleterious by SIFT. Source data: Supplementary Data 1 and 2.</span></div></td></tr></tbody></table><br /><div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjqjnyNppoetHs_FpYP-P9U2VWU8f2FTsKjsaEfseyyt4CFF87OKpWIR9SGEmg8gh6WmAFEe0VlV02mn17P2LLLUo1NNu-tNd6ZPwPN0tMpubq2E1KbofuJYYCVtnJaBFRmqULpCriCGbV66o8Bksnhj2mHw0CULOHDWmLH2epKraNFQj9MTMtEvS3k/s1107/PIC_3.jpg" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="1107" data-original-width="800" height="640" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjqjnyNppoetHs_FpYP-P9U2VWU8f2FTsKjsaEfseyyt4CFF87OKpWIR9SGEmg8gh6WmAFEe0VlV02mn17P2LLLUo1NNu-tNd6ZPwPN0tMpubq2E1KbofuJYYCVtnJaBFRmqULpCriCGbV66o8Bksnhj2mHw0CULOHDWmLH2epKraNFQj9MTMtEvS3k/w462-h640/PIC_3.jpg" width="462" /></a></div><br /></div><div><br /></div><div><div><span style="color: #6aa84f;"><b>AB-like tumor 基因變異與患者年齡的相關性</b></span></div><div> <br />該團隊發現許多 RNA fusion 或 mutation 發生在特定年齡層,例如:ABCC1 mutations/fusions 都發生在 16 歲以下患者 <span style="color: #ffa400;">( Fig 4g, 4h )</span>、VEZT/VEZF mutations 及 CTD-2152M20.2-GOLPH3 fusions 則在 25 歲以下患者的腫瘤中 <span style="color: #ffa400;">( Fig 4g, 4h )</span>、MEG8 fusions 大多數發生不超過 30 歲的女性,大多在 16 歲以下 <span style="color: #ffa400;">( Fig 4g, 4h )</span> 等等…,這些基因訊息的整合可以幫助罕見癌症 — 星形芽細胞瘤的了解,加以應用於診斷分類 <span style="color: #ffa400;">( Fig 8 )</span>。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjELzwRR_ZYuLGNlAeakzlG23exRJVj-j1K6TrDSfWbFFZc5QkX6szGWSfIUgogkXsIKyKXTQzMh5DIt_6u7Ajrs3Zpq4l6yOn2Avkvzi5FtCS9Z1h8Zg6Bw_RTJvLdbKA5hFvcUqc4Qbao8l43o0QFV9yx5t7O6fI0f0egEabqdoqd2R6ammXAEW2q/s800/PIC_4.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="444" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjELzwRR_ZYuLGNlAeakzlG23exRJVj-j1K6TrDSfWbFFZc5QkX6szGWSfIUgogkXsIKyKXTQzMh5DIt_6u7Ajrs3Zpq4l6yOn2Avkvzi5FtCS9Z1h8Zg6Bw_RTJvLdbKA5hFvcUqc4Qbao8l43o0QFV9yx5t7O6fI0f0egEabqdoqd2R6ammXAEW2q/s16000/PIC_4.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><div style="text-align: left;"><b>Figure 4. Astroblastoma-like tumor subtypes exhibit characteristic histologies and genetic alterations.</b></div><div style="text-align: left;"><span style="color: #999999;"><b>f, g</b> Mutations in AB-like tumor related genes occur in a patient age dependent manner. </span>ABCC1 mutations and fusions<span style="color: #999999;"> all occurred in patients 16 years old or less. Its highest expression in the Allen Human Developmental Transcriptome (AHDT) was before 25 pcw. VEZT and VEZF mutations and </span>CTD-2152M20.2-GOLPH3 fusions<span style="color: #999999;"> were all found in tumors from patients aged 25 and younger (Supplementary Data 2). The highest GOLPH3, VEZT and VEZF1 expression in the AHDT was under 25 pcw. </span>MEG8 fusions<span style="color: #999999;"> occurred only in females 30 years of age and younger, most below 16 years, and only in MN1-BEND2 and MAPK-A tumors. GRIA2 mutations were present in MAPK-ABC cases. ANK3, PARP8 and PTEN alterations were mostly present in non-BRAFV600E MAPK-AB patients. A </span>PARP8 fusion<span style="color: #999999;"> was present in a BRAFV600E tumor. Conversely, high GRIA2 expression spans the fetal and postnatal AHDT, but not below approximately 12 pcw. GRIA2 mutations are absent in MN1-rearranged tumors. Some genetic lesions were relatively specific to AB-like tumor genetic types: MN1-BEND2 fusions and ABCC1 mutation or fusion in MN1-rearranged tumors, and </span>TRIO and KALRN fusions<span style="color: #999999;"> in BRAFV600E tumors. SON mutations span the gamut of patient ages, as does its expression in the AHDT. These presumed somatic mutations were found in tumors clinically presenting at the indicated ages, however this data only indicates that the mutation was acquired in a patient sometime prior to that age, and some could have indeed been germline. Colors are arbitrary in f. In g MN1-BEND2 tumor mutated genes are in red and MAPK-ABC tumor mutated genes are in blue. Source data: Supplementary Data 1 and 2.</span></div></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhWLZgdGSOpHbd74ftTQ4J8Z3HRW50VIr7LBRWGQPsiAFyOluGEW2vxYW92_nm-SuX0gaYYZtXe8Dv27nO0xxbU9YiCiUHlTJPlnzXIutuQAUIR6olcUS6m1J6OiGGCv8Ix5Mu2USHi_p0wCDFn2Yd9UkatvSrEW99bygeL8jNI2hD1aeanwCIsBynA/s800/PIC_5.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="796" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhWLZgdGSOpHbd74ftTQ4J8Z3HRW50VIr7LBRWGQPsiAFyOluGEW2vxYW92_nm-SuX0gaYYZtXe8Dv27nO0xxbU9YiCiUHlTJPlnzXIutuQAUIR6olcUS6m1J6OiGGCv8Ix5Mu2USHi_p0wCDFn2Yd9UkatvSrEW99bygeL8jNI2hD1aeanwCIsBynA/s16000/PIC_5.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;"><b>Figure 8. Astroblastoma-like tumors show neural stem cell type-specific transcriptional lineage of developmentaly early (vRG) to later (oRG and tRG) radial glia and clinically present in comensurate sequencial patient ages.</b></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><div>雖然在早期癌細胞研究中就知道 RNA fusion 具有重要意義,但過去的技術限制了臨床 FFPE 樣品的搜尋範圍,使得以往 FFPE 樣品只能做 DNA 突變分析,無法進行 RNA fusion 偵測,因此無法有效的大規模尋找不同癌種、不同病程的 RNA fusion 現象。此篇文獻的結果可看到,FFPE RNA exome 除了可以計算基因表現外,也可以搜尋 RNA fusion 現象。當您在思考如何讓 Cancer WES 計畫具有更好的剖析深度時,FFPE RNA exome 將會是您的最佳選擇。</div><div><br /></div><div><br /></div><div><br /></div><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span><br />1. Mertens F., Johansson B., Fioretos T., Mitelman F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. <i>Nat. Rev. Cancer.</i> 2015;15:371–381. doi: 10.1038/nrc3947. <br />2. Mitelman, F., Johansson, B. & Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. <i>Nat. Rev. Cancer <b>7</b></i>, 233–245 (2007).welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-78137408089030881302022-09-02T01:02:00.003-07:002022-09-02T01:02:41.151-07:00【SureSelect WES 應用 - 1】急性淋巴性白血病 ( ALL ) 基因研究<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjns0A2F8CDc3zvokx5gysbMw90Btpqpr5ywRJF6lP6sBkZWBlGod_4ADgbmxENV7uFCCfJ6FvaVRzCbes7Q_QJF_HT6C-VXAiZxIXgFexIenUaECizuYXDdCdWUCptlCnsmloYzz9is0yQhJi6Fw2eEm25mD3itnhaaavITJ2PEnQtt5OXrjQ-WLYf/s797/BLOG.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="684" data-original-width="797" height="275" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjns0A2F8CDc3zvokx5gysbMw90Btpqpr5ywRJF6lP6sBkZWBlGod_4ADgbmxENV7uFCCfJ6FvaVRzCbes7Q_QJF_HT6C-VXAiZxIXgFexIenUaECizuYXDdCdWUCptlCnsmloYzz9is0yQhJi6Fw2eEm25mD3itnhaaavITJ2PEnQtt5OXrjQ-WLYf/s320/BLOG.jpg" width="320" /></a></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhtDyevxS28BGiVT1o0ajzW5_uwtASbJ_UNf_vjbu3FnIgM6uwtCAUyJXVzecB5LFu-94r7VgzvSVy_PZNA-dP4umQJOx1WtHtO0n-8z5CMwTcEpnbWGJTJNlxIRx3MyACO6bq2IStf-pHmCXMyxJBjUDOS4ET20i7Qns2vLGMYKh0B9W_pSZVLTcGI/s800/PIC_1.jpg" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="227" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhtDyevxS28BGiVT1o0ajzW5_uwtASbJ_UNf_vjbu3FnIgM6uwtCAUyJXVzecB5LFu-94r7VgzvSVy_PZNA-dP4umQJOx1WtHtO0n-8z5CMwTcEpnbWGJTJNlxIRx3MyACO6bq2IStf-pHmCXMyxJBjUDOS4ET20i7Qns2vLGMYKh0B9W_pSZVLTcGI/s16000/PIC_1.jpg" /></a></div><div><br /></div><div><table align="center" border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="table-layout: fixed; text-size-adjust: 100%; width: 100%px;"><tbody style="text-size-adjust: 100%;"><tr style="text-size-adjust: 100%;"><td align="left" style="max-width: 640px; text-size-adjust: 100%;" valign="top" width="100%"><div style="margin: 0px auto; max-width: 640px; padding: 0px; text-size-adjust: 100%; width: 640px;"><table align="center" bgcolor="#aaaaaa" cellpadding="0" cellspacing="0" class="block-inner" style="margin: 0px auto; position: relative; table-layout: fixed; text-size-adjust: 100%; width: 100%px;" valign="top"><tbody style="text-size-adjust: 100%;"><tr style="text-size-adjust: 100%;"><td align="left" class="block-content block-inner__content cBlock--spacingLR" style="padding: 24px 32px; text-size-adjust: 100%;" valign="top"><span style="color: white;">3 名急性淋巴性白血病 ( Acute lymphoblastic leukemia, ALL ) 兒童和配對 control 的骨髓樣本,進行 SureSelect V6 全外顯子基因分析 ( Whole Exome Sequencing, WES ),找到 10 個共同突變,確認出 FOXC1 基因發生 insertion ( H446HG )。</span></td></tr></tbody></table></div></td></tr></tbody></table></div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgSykSgRMo2GtmXBy348yz_RrN-xDxw_v5p-7xw6kXDxDjGJqdewquNP4FGR8h9LcIcSCSOS3jnO4gmatFCItn34aFcURmP-pnS0dWCmNB4YhsrnsXWNNKxiJRemt6_-Mq35KyAKEaYGulVzgBMx7J1Wan7Icqfr74Di7_7AI7okkUZuFHTtibQM8lx/s800/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="781" data-original-width="800" height="625" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgSykSgRMo2GtmXBy348yz_RrN-xDxw_v5p-7xw6kXDxDjGJqdewquNP4FGR8h9LcIcSCSOS3jnO4gmatFCItn34aFcURmP-pnS0dWCmNB4YhsrnsXWNNKxiJRemt6_-Mq35KyAKEaYGulVzgBMx7J1Wan7Icqfr74Di7_7AI7okkUZuFHTtibQM8lx/w640-h625/PIC_2.jpg" width="640" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">Fig 1. Exome sequencing in the bone marrow T cells of patients with ALL.</td></tr></tbody></table><br /><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEg7S86p5Brf-JteElH-0IkY3w52Jq10DUZQm0_JLFmw7lWazpaPQbHwLz7g8dUeiVKqTGkM5ml1adnXb2ZRJQEWAaw4BsNKA-NjEm69j7nsVKIVWMVegM34BkgI-7kahRSwcOCimqgxs7tN8xlxNmS_xqXJIGgLRfi3szVZRpgMba0OHBmCmbquO5KM/s800/PIC_3.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="781" data-original-width="800" height="624" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEg7S86p5Brf-JteElH-0IkY3w52Jq10DUZQm0_JLFmw7lWazpaPQbHwLz7g8dUeiVKqTGkM5ml1adnXb2ZRJQEWAaw4BsNKA-NjEm69j7nsVKIVWMVegM34BkgI-7kahRSwcOCimqgxs7tN8xlxNmS_xqXJIGgLRfi3szVZRpgMba0OHBmCmbquO5KM/w640-h624/PIC_3.jpg" width="640" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">Fig 2. The FOXC1 H446HG mutation is associated with increased Tregs.</td></tr></tbody></table><div><br /></div><div><div><table align="center" border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="table-layout: fixed; text-size-adjust: 100%; width: 100%px;"><tbody style="text-size-adjust: 100%;"><tr style="text-size-adjust: 100%;"><td align="left" style="max-width: 640px; text-size-adjust: 100%;" valign="top" width="100%"><div style="margin: 0px auto; max-width: 640px; padding: 0px; text-size-adjust: 100%; width: 640px;"><table align="center" bgcolor="#aaaaaa" cellpadding="0" cellspacing="0" class="block-inner" style="margin: 0px auto; position: relative; table-layout: fixed; text-size-adjust: 100%; width: 100%px;" valign="top"><tbody style="text-size-adjust: 100%;"><tr style="text-size-adjust: 100%;"><td align="left" class="block-content block-inner__content cBlock--spacingLR" style="padding: 24px 32px; text-size-adjust: 100%;" valign="top"><span style="color: white;">為瞭解 FOXC1 H446HG 是否為 ALL 患者的致病原因,觀察 FOXC1 overexpression 後免疫系統狀況,發現調節型 T 細胞 ( Treg ) 增加、胞殺型 T 細胞 ( CTL ) 減少 </span><span style="color: #f9cb9c;">( 3a, 3b )</span><span style="color: white;">。</span></td></tr></tbody></table></div></td></tr></tbody></table></div><div><br /></div></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgtDQTYma7frKYGlBlkEC-Zhj5FLtbyQ6SREqXPhUaW2YBnXA0mRxZzaA_tpTvqElebiFFUCu4MPs1GxHvkinIFBp3xAcqTEItS8Kw9FpvS9HU7YV6IURtb7pWxe7xdPcZ1lTXu_1sBn3EXE3cU-mXVuSiCoeGUC8e0mST4LFZz6AiwD57L0PHbnCtx/s800/PIC_4.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="452" data-original-width="800" height="362" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgtDQTYma7frKYGlBlkEC-Zhj5FLtbyQ6SREqXPhUaW2YBnXA0mRxZzaA_tpTvqElebiFFUCu4MPs1GxHvkinIFBp3xAcqTEItS8Kw9FpvS9HU7YV6IURtb7pWxe7xdPcZ1lTXu_1sBn3EXE3cU-mXVuSiCoeGUC8e0mST4LFZz6AiwD57L0PHbnCtx/w640-h362/PIC_4.jpg" width="640" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">Fig 3. The FOXC1 H446HG mutation induces the Treg/CTL shift.</td></tr></tbody></table><br /><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgGlmGScIwIkgo_TAd_Xwp9tPMuA6eXy32EudiFhhG0HkVirgGuiGQyhNYy3u7BouSLD0ntF-gB6DEMqAgP-kE9jgqDNZOordwkHYU74ZKRG4enC7png6pj0cyjq9qhU0CqKl7Mv9uPPU2o5sduAteEBzqfSpCbD1y3LV7_zo5EQL0t7AdsB9d8Pk_y/s799/PIC_5.png" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="792" data-original-width="799" height="396" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgGlmGScIwIkgo_TAd_Xwp9tPMuA6eXy32EudiFhhG0HkVirgGuiGQyhNYy3u7BouSLD0ntF-gB6DEMqAgP-kE9jgqDNZOordwkHYU74ZKRG4enC7png6pj0cyjq9qhU0CqKl7Mv9uPPU2o5sduAteEBzqfSpCbD1y3LV7_zo5EQL0t7AdsB9d8Pk_y/w400-h396/PIC_5.png" width="400" /></a></div><br /><div>FOXC1 突變引發 ALL 患者免疫微環境中的 T 細胞分化異常,在致病基因資料還不充足時,SureSelect WES 有助於初步研究潛在的突變基因 candidate,FOXC1 mutation 為 ALL 疾病提供一個新的可能治療目標。</div><div><br /></div><div><br /></div><div><br /></div><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span><br />1.<a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9065155/" target="_blank"><i> Cell Death Dis.</i></a> 2022 May; 13(5): 431.<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiiaTH5yUKI7xh1I6HpsCVZ2lPUV-hmBX7_VeeJF4PB2cn4y7DsnudlEDj2-ddVFFyBrL02jW-TF6LFOBnp0m3GzMCX4wT0JeCySWi0qpyxKl2OxJnG6if85QoT63k2G26Ss3Q1tXTapeBxnuXKYW-EtpnRVAdh0C8z8ewltztz2R4hKjQ74VZs_Tft/s800/PIC_6.jpg" style="clear: left; float: left; margin-bottom: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="120" data-original-width="800" height="48" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiiaTH5yUKI7xh1I6HpsCVZ2lPUV-hmBX7_VeeJF4PB2cn4y7DsnudlEDj2-ddVFFyBrL02jW-TF6LFOBnp0m3GzMCX4wT0JeCySWi0qpyxKl2OxJnG6if85QoT63k2G26Ss3Q1tXTapeBxnuXKYW-EtpnRVAdh0C8z8ewltztz2R4hKjQ74VZs_Tft/s320/PIC_6.jpg" width="320" /></a></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-9498611122343511962022-08-12T00:45:00.018-07:002023-01-09T23:46:04.753-08:00【SureSelect RNA Capture 應用介紹 - 1】腫瘤 WES / WGS 研究的 RNA Expression & Fusion 搭配<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgPzp6w3IXn_1I8iXX0NZGyCvUR2kt3XX8hZbSCE2kH5BHVOvX4v8J56-rih21UZKumSe_hH4Y1gI37KH9GwR9M2a_mVecuae0KXrrUcy-Bex5XXRGr2vDxU9GPk5OvbT0ja0Uj1-TBWYJficeyw3EQeL0JOIyzc-8eNunvk8a4u9IPns8g2dM2-LL1/s800/BLOG.jpg" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="679" data-original-width="800" height="272" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgPzp6w3IXn_1I8iXX0NZGyCvUR2kt3XX8hZbSCE2kH5BHVOvX4v8J56-rih21UZKumSe_hH4Y1gI37KH9GwR9M2a_mVecuae0KXrrUcy-Bex5XXRGr2vDxU9GPk5OvbT0ja0Uj1-TBWYJficeyw3EQeL0JOIyzc-8eNunvk8a4u9IPns8g2dM2-LL1/s320/BLOG.jpg" width="320" /></a></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><br /></div>許多大型基因研究計畫穩步累積了大量的疾病與基因資料,大部分先探討 DNA 編碼基因區域與疾病的關係,奠立 Exome / DNA 訊息與醫學應用的根基,但 DNA 只能代表癌症分子資訊的一個面向,因此近年越來越多的研究加入其他層面的資料,如 Transcriptomics、Proteomics 或 Metabolomics 等,形成癌症多體學 ( Multi-omics ) 研究。在許多的搭配中,RNA 實驗因可獲得基因調控資訊,而成為最直接的搭配實驗,另外因 RNA 定序深度增加與 RNA Capture 技術的進化,一筆實驗數據即可同時獲得 RNA expression 與 RNA fusion 資訊,一併探尋新的 fusion 存在或討論現有 actionable drug 沿用的可能性。<div><br />基於這樣的脈絡,密西根大學轉譯病理中心 ( Michigan Center for Translational Pathology, University of Michigan ) 於 2017 年在 Nature 期刊發表了 500 名轉移性癌症 ( metastatic solid tumors ) 患者 SureSelect WES、Transcriptome、TCRß-seq 研究結果 <a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5995337/" target="_blank"><b><i>1</i></b></a>,剖析了五個角度變化 <span style="color: #ffa400;">( 圖一 )</span>。</div><div><br />● Molecular aberrations</div><div>● Pathogenic germline variants</div><div>● Gene fusion landscape</div><div>● Transcriptional signatures</div><div>● Immune microenvironment</div><div><br />在常見的 WES TMB 與突變基因群的描繪後,以 RNA-seq 發現許多 RNA fusion 現象 <span style="color: #ffa400;">( Figure. 2 )</span>,約有 39.8% 的樣品具有一個以上的潛在致病融合 RNA ( putative pathogenic fusion ),融合現象除了可能造成原基因功能喪失外,也可能影響到 DNA-binding, protein kinases, 及 signal transducers 等基因功能。並在數據中找到 8 個可能致病的 novel fusion pairs,這些 fusions 啟動了 FGFR, BRAF, 及 ALK 的表現,這樣的 DNA + RNA 的定序策略,有效的將癌症主題由單一層次進行研究擴展,並結合臨床 actionable 資訊進行討論。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgLFdi0jRy14Y5yRhcuQWnn3Y0nR7D3fcCyT-aJ8Lb0pECazuUSQi32WGgOLxZtTuRs_yayM4OSQR-TUYip12lfIZ3-pptwSZXjP01_ctub2R7dDQbaw12-_EiSryPPNbWBudeMTw05H6ZVQz37vaeg34HNANAJFPirJQ_5gRoZrspqmLfsSZzFNG_i/s800/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="474" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgLFdi0jRy14Y5yRhcuQWnn3Y0nR7D3fcCyT-aJ8Lb0pECazuUSQi32WGgOLxZtTuRs_yayM4OSQR-TUYip12lfIZ3-pptwSZXjP01_ctub2R7dDQbaw12-_EiSryPPNbWBudeMTw05H6ZVQz37vaeg34HNANAJFPirJQ_5gRoZrspqmLfsSZzFNG_i/s16000/PIC_1.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【圖一】Integrative clinical genomics of metastatic cancer 研究中分析的五個方向</td></tr></tbody></table><br /><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjSd7gypaz5kVZMko-Gk1eGtT3u6O_AgkNvLCPhbiXWyWoODzfZiLvdG_NEy5rIk52pd78m5penWxe92vZQ4kMT7w6TN6bnemiocUw8uPGmcVMRMrpDzZs2qXu604IdyVHJBglc1Ri7pEp0-AQPfqdRR2Xz1jdrhbt1NVuUIZsMaVmL1oTo8CfcrG15/s912/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="912" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjSd7gypaz5kVZMko-Gk1eGtT3u6O_AgkNvLCPhbiXWyWoODzfZiLvdG_NEy5rIk52pd78m5penWxe92vZQ4kMT7w6TN6bnemiocUw8uPGmcVMRMrpDzZs2qXu604IdyVHJBglc1Ri7pEp0-AQPfqdRR2Xz1jdrhbt1NVuUIZsMaVmL1oTo8CfcrG15/s16000/PIC_2.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><div style="text-align: left;">【Figure 2】Diverse classes of gene fusions identified in metastatic cancers</div><div style="text-align: left;"><span style="color: #999999;"><b>a.</b> Fusions classified by underlying structural aberrations. <b>b.</b> Functional gene fusions identified in the MET500 cohort. <b>c.</b> Molecular structure of novel, potentially activating, gene fusions in the MET500 cohort.</span></div></td></tr></tbody></table><br /><br />SureSelect 做為基因捕抓技術的代表,也具備許多 RNA fusion 技術應用,包括全外顯子 ( Exome )、特定基因範圍 ( 如:Kinome )、抑或客製基因內容,都可彈性配合各種疾病主題,探討 RNA 分子層面代表的病理意義。接下來將進行下列幾篇 RNA Fusion 研究介紹,還請先進們持續關注、多多指教。<br /><br /><b>a. RNA Exome 應用</b><br /><ul style="text-align: left;"><li>Astroblastomas exhibit radial glia stem cell lineages and differential expression of imprinted and X-inactivation escape genes <a href="https://www.nature.com/articles/s41467-022-29302-8" target="_blank"><i><b>2</b></i></a></li></ul><b><div><b><br /></b></div>b. RNA Kinome 應用</b><br /><ul style="text-align: left;"><li>Identification of targetable kinases in idiopathic pulmonary fibrosis <a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35130915/" target="_blank"><i><b>3</b></i></a></li></ul><div><br /></div><b>c. RNA Custom Fusion/Splicing 應用</b><br /><ul style="text-align: left;"><li>Genomic heterogeneity of ALK fusion breakpoints in non-small-cell lung cancer <a href="https://www.nature.com/articles/modpathol2017181" target="_blank"><i><b>4</b></i></a></li><li>RhoGAP domain-containing fusions and PPAPDC1A fusions are recurrent and prognostic in diffuse gastric cancer <a href="https://www.nature.com/articles/s41467-018-06747-4" target="_blank"><i><b>5</b></i></a></li><li>Accurate detection of tumor-specific gene fusions reveals strongly immunogenic personal neo-antigens <i><b><a href="https://www.nature.com/articles/s41587-022-01247-9" target="_blank">6</a></b></i></li></ul><br /><br /><br /><span style="color: #ffa400;"><b>【參考資料】</b></span><br />1. Robinson, D., Wu, YM., Lonigro, R. et al. Integrative clinical genomics of metastatic cancer. Nature 548, 297–303 (2017).<br />2. <a href="https://www.nature.com/articles/s41467-022-29302-8" target="_blank">https://www.nature.com/articles/s41467-022-29302-8 </a><br />3. <a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35130915/" target="_blank">https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35130915/</a><br />4. <a href="https://www.nature.com/articles/modpathol2017181" target="_blank">https://www.nature.com/articles/modpathol2017181</a><br />5. <a href="https://www.nature.com/articles/s41467-018-06747-4" target="_blank">https://www.nature.com/articles/s41467-018-06747-4 </a><br />6. <span style="color: #2b00fe;"><a href="https://www.nature.com/articles/s41587-022-01247-9" target="_blank">https://www.nature.com/articles/s41587-022-01247-9</a></span>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-8797211823942972222022-07-29T00:56:00.001-07:002022-07-29T00:56:18.281-07:00外顯子與臨床醫學的交會點 — SureSelect 自動化平台<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhC5BuV28JM2h2VEZh5oSa0hf7cczJSd1gyV8SZYvXEWdfNGEO2NdAvXT0o_PG9jQIWQzZ3yKuPsfWAORqpvWaABLvp78JVK1gctPORfZXXOU17j1aLZuR9GR-bs3kDjRCccXG7hAjzlwaPgLFBrQkzZGBSDPOnDS87wbCQhH312jmGGdwaId4wtRNC/s800/PIC_1.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="292" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhC5BuV28JM2h2VEZh5oSa0hf7cczJSd1gyV8SZYvXEWdfNGEO2NdAvXT0o_PG9jQIWQzZ3yKuPsfWAORqpvWaABLvp78JVK1gctPORfZXXOU17j1aLZuR9GR-bs3kDjRCccXG7hAjzlwaPgLFBrQkzZGBSDPOnDS87wbCQhH312jmGGdwaId4wtRNC/s16000/PIC_1.jpg" /></a></div><div><br /></div>隨著 2000 年人類全基因體序列的公布,全世界競相投入基因體醫學開發,一陣衝刺之後發現到了許多落差,例如許多疾病與基因間未有明確對應性、臨床樣品不能隨意取樣、樣品量少、核酸高度降解、正常與變異細胞混雜等諸多實際狀況。當時的基因晶片技術雖能提供大量資訊,但在技術力上只適合單純已知變異的疾病,因此 NGS 在 2005 - 2006 年登場後被寄予厚望,希望它的 single base resolution、de novo mutation 偵測能力、海量定序片段等優勢,能夠克服臨床樣品的挑戰。<br /><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjrplcGm0kUfpG-QH7EdZ_PNqWoxhfOfWNT_UKlWOkCRDxqrxz8IhHh5OOk3R7vVCAXpxi0ebvAA5R_PSqmzdYYyAN7dPPwz57sdZ9PtMJH4_pSJBJGU5gSu6-14UIgGtmSBuu5I5_9m_Thr1DbjwJElDN7zQmrtb4xTWLdMyitUf4NUKtUEXcI1GDP/s800/PIC_2.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="243" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjrplcGm0kUfpG-QH7EdZ_PNqWoxhfOfWNT_UKlWOkCRDxqrxz8IhHh5OOk3R7vVCAXpxi0ebvAA5R_PSqmzdYYyAN7dPPwz57sdZ9PtMJH4_pSJBJGU5gSu6-14UIgGtmSBuu5I5_9m_Thr1DbjwJElDN7zQmrtb4xTWLdMyitUf4NUKtUEXcI1GDP/s16000/PIC_2.jpg" /></a><br /><br />2005 年,Agilent Technologies 已是合成式生物晶片領導廠商,正與荷蘭 Agendia 醫院合作以基因晶片評估乳癌病患預後風險 ( 2007 年通過 US FDA IVD 認證, <b><i>Ref 1</i></b> ),也思索著如何將自身的高通量 Oligo 晶片合成技術與 NGS 結合,提供下一世代基因偵測需要。Agilent 隨後與哈佛大學、麻省理工學院 Broad Institute 合作,開創了 NGS 液相基因片段捕抓法,2009 年時發表了第一套人類外顯子 ( Exome ) 技術 — SureSelect Human Exome。SureSelect 問世的 5 年內,全世界的遺傳、癌症基因體計畫 ( 如 TCGA 與 ExAC 的研究群 ),基於 SureSelect 累積了 6 萬筆以上的全外顯子 ( WES ) 數據,奠定了精準醫學基礎。<br /><br />Agilent Technologies 做為臨床晶片廠商與 Exome 技術開創者,深刻認知到 " 研究技術 " 與 " 臨床應用 " 之間的鴻溝。以當時的 Exome 技術而言,需要 3ug 的高完整度 DNA、每次只能處理 8 - 16 個樣品、一次需要 4 - 5 天的複雜操作,與臨床需要的快速、彈性、大量有著巨大差異,Exome 只能用於無時間壓力、樣品容易取得的罕病遺傳檢查,無法用於短時間、微量、高度降解、細胞組成複雜的癌症醫學。因此 Agilent 基於臨床實用理念,訂立了數個研發目標,並於 10 年間一步步的將科學研究技術轉變成 <b>SureSelect 精準醫學平台:</b><br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">1. 要能搭配 FFPE、Liquid Biopsy</span></b><br /><br /></div><div class="separator" style="clear: both;">針對臨床日常的 FFPE 切片與血液相關 ( Liquid Biopsy, cfDNA/RNA ) 樣品最佳化。這類樣品通長只有 ~10 ng 的微量低品質 DNA/RNA,容易造成實驗數據誤差。Agilent 率先將分子條碼 ( molecular barcode ) 導入 FFPE/Liquid Biopsy Capture-base Exome,可在微量的 DNA/RNA input 下達到 < 1% VAF 偵測靈敏度,做到臨床檢體可靠 Exome 定序。</div><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhYPeU6EEeeeN3JjmmZXzXxNohsCbS9LeEm4GPl14XwF6qQToflAHNPnGX_HuVwqNQs3tcsNjgKmTETWv4iYJaw5v4YSmwkVBhvgQWJNTzRdjuYFjRp7UrxbozRwsiZ1hWLIU5ZlQXCgunjilSjIZ3Cc0Dk4JWHISqDgoONtGqk9zYPMO2QHGE4D6Yr/s800/PIC_3.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="479" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhYPeU6EEeeeN3JjmmZXzXxNohsCbS9LeEm4GPl14XwF6qQToflAHNPnGX_HuVwqNQs3tcsNjgKmTETWv4iYJaw5v4YSmwkVBhvgQWJNTzRdjuYFjRp7UrxbozRwsiZ1hWLIU5ZlQXCgunjilSjIZ3Cc0Dk4JWHISqDgoONtGqk9zYPMO2QHGE4D6Yr/s16000/PIC_3.jpg" /></a><br /><br /><br /><span style="color: #6aa84f;"><b>2. 符合彈性、快速需求</b></span><br /><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEifVFK_bNB6JM37L4O06N2f8lcVrkShWWearOX_aw-5-bXVeSSj6vZ4XjyiGh6bDZPvTjxB0_aB1ZU0Osxej5szsQPqbOM_zh7Z7xsEZDeV2EicGuSIzB0nP6-qUmHzaX4hN5IgYKOI0SKAq55k04WeO93GFVqxd1Ga4dfoDW2Cgf_HvjjDckU0LB6A/s800/PIC_4.jpg" imageanchor="1" style="clear: right; float: right; margin-bottom: 1em; margin-left: 1em;"><img border="0" data-original-height="451" data-original-width="800" height="225" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEifVFK_bNB6JM37L4O06N2f8lcVrkShWWearOX_aw-5-bXVeSSj6vZ4XjyiGh6bDZPvTjxB0_aB1ZU0Osxej5szsQPqbOM_zh7Z7xsEZDeV2EicGuSIzB0nP6-qUmHzaX4hN5IgYKOI0SKAq55k04WeO93GFVqxd1Ga4dfoDW2Cgf_HvjjDckU0LB6A/w400-h225/PIC_4.jpg" width="400" /></a></div>臨床醫療為了疾病競爭,因此極度重視速度。並為了應付突發狀況,需要高彈性的技術設計。Agilent 自初代 SureSelect 就堅持一個樣品就能分析的設計,不斷改良流程,將製備 ( Library Preparation ) 時間縮減到只需 10 小時,即使只有一個樣品,一天內就能送入定序儀,以最彈性的設計,協助第一線進行高效率的 Exome 操作。<br /><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div><b><span style="color: #6aa84f;">3. 真正的自動化</span></b><br /><br />在高工作強度的臨床環境,自動化的必要性無庸置疑。Exome 自動化不只是避免操作失誤或增加穩定度而已,而是將人力放在更重要的基因報告上,後端報告是目前最重要,也無法由機器處理的部分。而許多的自動化只為了學術實驗設計,有著流程分段、前/後置整理耗時、無 biohazard 考量、無法彈性上樣等問題。Agilent 十分熟悉臨床需求,將 SureSelect 操作整合成全自動、簡易流程,省下寶貴人力於後端報告處理/校對,提升檢測品質。<div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjRvCLr-g8or0S3KC-F4mCJWG5KKfkb3q8NlIWb2ikMDvX7v3pY9JSDKsVKFnLPIsSOpZFyXo5luKQx-BsjIygpQGYaa-ZHkOEwIofVAmIpSSXukSSABLPhcI5Z7wUpmkAwPHS9xHXXlzD_PnIbY7P7BCbDox4klGVoHUfx0gQvvimCz0QjORNkM60t/s800/PIC_5.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="372" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjRvCLr-g8or0S3KC-F4mCJWG5KKfkb3q8NlIWb2ikMDvX7v3pY9JSDKsVKFnLPIsSOpZFyXo5luKQx-BsjIygpQGYaa-ZHkOEwIofVAmIpSSXukSSABLPhcI5Z7wUpmkAwPHS9xHXXlzD_PnIbY7P7BCbDox4klGVoHUfx0gQvvimCz0QjORNkM60t/s16000/PIC_5.jpg" /></a></div><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">4. 無縫銜接醫院流程</span></b><br /><br />精準醫學檢測導入的一個大挑戰,是在無法與既有的醫院流程相容。許多的學術實驗要求與實際臨床狀態衝突,像是第一步的 DNA/RNA QC 就有操作複雜、品質標準不一的問題。除了造成臨床人員的工作負擔外,也讓檢測結果多了糾紛疑慮。因此 Agilent 以自動化來銜接醫院流程的樣品,並與日本病理學會合作獲得 FFPE 檢體 QC ( DIN/RIN/DV200 ) 標準的臨床建議。讓整個流程在步驟上與要求上,盡量與臨床無縫銜接。<div><br /></div><div class="separator" style="clear: both;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiuCdYRQ9zUjjN6Xf9PAtX235rX8j3HnINWLQwCKEzCV_QGSn8TdlXzmdIF5O0nG75bT7ziys0CTingETiiF9bJLOMBYfMUyUe-qRWAvYoM_3gClnH27DOAALIO9Nsh9XS2QAcsbKAEcreGZUyhKApy-pL6ZaAN59wy0q8bcXlPH88OemIouULqHbLL/s800/PIC_6.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="570" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiuCdYRQ9zUjjN6Xf9PAtX235rX8j3HnINWLQwCKEzCV_QGSn8TdlXzmdIF5O0nG75bT7ziys0CTingETiiF9bJLOMBYfMUyUe-qRWAvYoM_3gClnH27DOAALIO9Nsh9XS2QAcsbKAEcreGZUyhKApy-pL6ZaAN59wy0q8bcXlPH88OemIouULqHbLL/s16000/PIC_6.jpg" /></a><br /><br /><br />這些基本務實理念的背後,其實是一個橋接兩個在條件、嚴謹度、責任、文化、狀態、需求上差異巨大體系的工程,一般常以轉譯 ( translation ) 來描述,但本質上它已是轉化 ( transformation ),需要先把 Exome 技術核心變為臨床思維,再將儀器平台以臨床生態來塑形。開發史上已有許多失敗案例,即使是 Agilent 這樣的技術開創者也是個艱鉅挑戰。10 年無數人力物力的投入後,終於在 2019 推出了第一套 CE-IVD Exome 處理系統 一 SureSelect Magnis 全自動系統。Magnis 除了創造新技術高度外,更以 SureSelect 核心來設計臨床解決方案,集穩定、標準化、快速操作於一系統,讓 Exome 臨床應用性不被侷限。<br /><br />有了臨床信賴的的穩定、準確性,精準醫療在 CE-IVD Exome 系統協助下已能真正落實。Agilent 以 10 年時間一邊轉化 Exome 核心,一邊配合 NGS 定序儀的進展,一步一步開發基因醫學實用技術,最後以 <b>SureSelect 自動化平台</b>達到了基因體與臨床醫學的交會點。Agilent 的 SureSelect 技術奠定了精準醫學基礎,而未來會持續以信賴、實用理念,推動個人化基因醫學的前進。</div><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgkhziTVTYXUDHiERDG-Jpk5RgJ_dAtJF8ploGJNIoib2cyYWD8S2aZBPfeUe-LUmC6uo41gbEyCCSy-OwojNh8T5l6iAHh-mSCRyggZjpVz_rXkG3Z9WH44nr_RbTmSa8jKDMkJUqKlACW9W1QdVrJfsI2lBJzEG0Vx9poqxIDBdcbsAl7X5c5XXuE/s800/PIC_7.png" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="412" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgkhziTVTYXUDHiERDG-Jpk5RgJ_dAtJF8ploGJNIoib2cyYWD8S2aZBPfeUe-LUmC6uo41gbEyCCSy-OwojNh8T5l6iAHh-mSCRyggZjpVz_rXkG3Z9WH44nr_RbTmSa8jKDMkJUqKlACW9W1QdVrJfsI2lBJzEG0Vx9poqxIDBdcbsAl7X5c5XXuE/s16000/PIC_7.png" /></a></div><br /><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both;"><div class="separator" style="clear: both;"><b><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span></b></div><div class="separator" style="clear: both;">1. <a href="https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/reviews/k062694.pdf" target="_blank">https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/reviews/k062694.pdf</a></div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-87132894987908252292022-07-15T02:02:00.000-07:002022-07-15T02:02:44.309-07:00腦神經系統單細胞 FL-cDNA 解析,單細胞 + SureSelect V8 + 三代定序雙平台通用的 SnISOr-Seq 技術<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjqxr9ByfHYYwGjloCxvdiUTSjjXzWF7wn14n-SHdL8gPNi203U41PY8mYNplDF3ZOIe7IbwmxjUa2a4Zm13nq5Iyl8DYQDlud8VQBuxTSV8VODn2IuJaHNXxklrMQQEcfQfF8XX0RnAhOrPcDKrt0UhSjGO6cTh612PbmTz1Khgq0_Pa6L2EDFNY_8/s795/BLOG.jpg" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="385" data-original-width="795" height="155" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjqxr9ByfHYYwGjloCxvdiUTSjjXzWF7wn14n-SHdL8gPNi203U41PY8mYNplDF3ZOIe7IbwmxjUa2a4Zm13nq5Iyl8DYQDlud8VQBuxTSV8VODn2IuJaHNXxklrMQQEcfQfF8XX0RnAhOrPcDKrt0UhSjGO6cTh612PbmTz1Khgq0_Pa6L2EDFNY_8/s320/BLOG.jpg" width="320" /></a></div><div><br /></div><div>單細胞 ( Single Cell ) 定序技術的誕生,讓生醫研究進入新的維度。研究者能以「單一細胞」的程度來觀察數千-百萬顆細胞的獨特內容,後以大數據演算彙整眾多細胞的細微基因訊息,架構並定義出數位化生物調控模型,為許多舊問題提出更高維度的觀點,並提供新的探索方向。而單細胞加上新興三代定序技術,可望帶來生醫研究的另一波突破。</div><br /> 三代定序的特色是超長片段、單分子序列讀取,早期三代定序技術的正確性與可分析性不足,單細胞技術多以一般 NGS ( 二代定序 ) 搭配分析;隨著三代定序技術趨於成熟,長片段定序方法 ( Long-read sequencing ) 克服了一般 NGS 短片段定序 ( Short-read sequencing ) 的瓶頸,對於基因體大型結構變異 ( Large Structural Variation )、重複序列 ( Repeated Sequence )、複雜基因組合 ( recombination、splicing ) 等…可進行完整的序列分析。2022 年 Nature Biotechnology 期刊發表了「單細胞技術」結合「SureSelect V8」、「三代定序」的 single-nuclei isoform RNA sequencing ( SnISOr-Seq ) 方法,建立了一個能取得全長 cDNA ( Full-Length cDNA, FL-cDNA, 包含 UTR+CDS+polyA ) 表現內容,能通用於 PacBio、Nanopore 雙三代平台,並大幅提升 7.5 倍可用定序量的技術。該研究團隊利用 SnISOr-Seq 探討了腦神經系統單細胞 FL-cDNA 基因表現,藉著基因訊息試著解開人類大腦功能的分化及特定細胞類型的功能,研究成果如下:<div><br /></div><div> <br /><b><span style="color: #6aa84f;"><i>1. 實驗方法大綱</i></span></b></div><div><br />兩個 30 mg 快速冷凍的新鮮正常腦部皮質 ( Cortex ) 抽出 nuclei 後,以 10X Single Cell 3ʹ GEM kit 進行初步文庫處理,處理後每顆 nuclei 會產生 有/無 具有 barcode 辨識序列的 cDNA library <span style="color: #ffa400;">( Fig 1a, 1b, 1c )</span>。此時取出 30ng 的 cDNA library 進行 Linear/asymmetric PCR 步驟以放大帶有 barcode 辨識序列的 cDNA。後使用 SureSelect V8 抓取下 CDS 高佔比的 spliced cDNA 文庫 <span style="color: #ffa400;">( Fig 1d )</span>,搭配 PacBio SMRTbell Express Template Prep Kit 或 Nanopore Ligation Sequencing Kit 完成文庫製備,並以對應的三代平台進行定序。研究團隊並基於不同三代平台數據特性,擬定平台最適化的序列去除錯誤、去除 artifacts、barcode 合併。獲得的高品質三代定序數據再與平行實驗的 illumina 二代數據比對確認一致度。並架構 exon 使用分類群模型,分析 FL-cDNA 內各 exon 的使用狀況。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhlFGbZctYIu9ZMA0mNNuznxEREIielnDWKy0Nbjs5UDDfDnzmUS5HmEnRoYDwlDyzCzJH-UG9Nm1SMQGOKm8vleTbN09bjroU8QES_yIxlAo5LDqx05nGwEf-59qVsmu2XFps4r1EcJtkXrVjT7Mr4UkW7Qs6b23A8v9giKQ5TR_9L6O_21FVR_-6o/s1232/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="1232" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhlFGbZctYIu9ZMA0mNNuznxEREIielnDWKy0Nbjs5UDDfDnzmUS5HmEnRoYDwlDyzCzJH-UG9Nm1SMQGOKm8vleTbN09bjroU8QES_yIxlAo5LDqx05nGwEf-59qVsmu2XFps4r1EcJtkXrVjT7Mr4UkW7Qs6b23A8v9giKQ5TR_9L6O_21FVR_-6o/s16000/PIC_1.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><b>Fig 1: Overview of the SnISOr-Seq approach.</b></div><div style="text-align: left;"><span style="color: #999999;"><b>a</b>, Barcoded cDNA library of nuclei isolated from frozen human brain tissue. <b>b</b>, Three main types of molecules generated: spliced barcoded (known and novel isoforms), unspliced barcoded (exclusively intronic nucleotides) and incomplete cDNA without a cellular barcode. <b>c</b>, Linear/asymmetric PCR ('LAP') is used to selectively amplify barcoded cDNA. <b>d</b>, Probe-based exome capture ('CAP') step is applied to filter out purely intronic cDNA molecules. <b>e</b>, Molecules are sequenced on a long-read sequencer (PacBio and ONT).</span></div></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><b><span style="color: #6aa84f;"><i>2. SnISOr-Seq 系統建立與分析 / 方法測試</i></span></b><div><br /></div><div>皮質包括神經元 ( Neuron )、星形膠質細胞 ( astrocytes )、寡突膠質細胞 ( oligodendrocytes )、小膠質細胞 ( microglia )、血管細胞 ( vascular cells ),首先使用兩個獨立樣品來源的健康額葉皮層組織 ( Cortex 1, Cortex 2 ),分別進行單細胞定序分析,得將之區分出 12 類皮質細胞類型 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2a )</span>,而神經元部分可細分出許多如:SST<sup><span face=""微軟正黑體",sans-serif" lang="EN-US" style="color: #111111; font-size: medium; mso-ansi-language: EN-US; mso-bidi-font-family: 新細明體; mso-bidi-language: AR-SA; mso-fareast-language: ZH-TW;">+</span></sup>、LAMP5<sup><span face=""微軟正黑體",sans-serif" lang="EN-US" style="color: #111111; font-size: medium; mso-ansi-language: EN-US; mso-bidi-font-family: 新細明體; mso-bidi-language: AR-SA; mso-fareast-language: ZH-TW;">+</span></sup>、PVALB<sup><span face=""微軟正黑體",sans-serif" lang="EN-US" style="color: #111111; font-size: medium; mso-ansi-language: EN-US; mso-bidi-font-family: 新細明體; mso-bidi-language: AR-SA; mso-fareast-language: ZH-TW;">+</span></sup> 中間神經元 ( interneuron ),及 RORB<sup><span face=""微軟正黑體",sans-serif" lang="EN-US" style="color: #111111; font-size: 12pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-bidi-font-family: 新細明體; mso-bidi-language: AR-SA; mso-fareast-language: ZH-TW;">+</span></sup>、SEMA3E<sup><span face=""微軟正黑體",sans-serif" lang="EN-US" style="color: #111111; font-size: 12pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-bidi-font-family: 新細明體; mso-bidi-language: AR-SA; mso-fareast-language: ZH-TW;">+</span></sup>、LINC00507<sup><span face=""微軟正黑體",sans-serif" lang="EN-US" style="color: #111111; font-size: 12pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-bidi-font-family: 新細明體; mso-bidi-language: AR-SA; mso-fareast-language: ZH-TW;">+</span></sup> 興奮性神經元 ( excitatory neuron )。為評估 LAP-CAP <span style="color: #ffa400;">( Fig 1c, 1d )</span> 建庫處理是否助於定序表現,針對 LAP-CAP 處理前後的樣品進行三代定序 ( PacBio 及 ONT ),確認了經由 SnISOr-Seq 方法所得的目標訊號較一般 long read ISO-seq 結果高約 7.5 倍 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2b )</span>,也觀察到健康皮質樣本兩者之間基因表現的高相關性 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2c )</span>,確認了 SnISOr-Seq 系統的高再現性。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiH3sW2ogUGjwyspW2MVyOsea4x9H2IJR5Pt-qVBqs8SuVKHiYCThj9LRc98NYfAH2d_isFqRtZeJMdG4cIv01vnURR-T9rAkf02Cbt-fWHvYuED_9NMsJBoer6Fo2zKF16B8UEkJ3dUSJBMamVdq-VeaUZ824bM6d-YQBCIlf2JKoASd1wG8OewFfw/s800/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="261" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiH3sW2ogUGjwyspW2MVyOsea4x9H2IJR5Pt-qVBqs8SuVKHiYCThj9LRc98NYfAH2d_isFqRtZeJMdG4cIv01vnURR-T9rAkf02Cbt-fWHvYuED_9NMsJBoer6Fo2zKF16B8UEkJ3dUSJBMamVdq-VeaUZ824bM6d-YQBCIlf2JKoASd1wG8OewFfw/s16000/PIC_2.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><b>Fig. 2: Cell type clustering and enrichment efficiency.</b><br /><span style="color: #999999;"><b>a</b>, UMAP plot of the Cortex1 sample with each point representing a single nucleus and colors indicating cell type. <b>b</b>, Bar plot showing the barcode detection rate, on-target rate and fraction of reads that are usable (that is, barcoded and on-target). Color of bars indicates experimental approach: naive single-nuclei long read (light gray) as a control; LAP (dark gray); SnISOr-Seq (black). <b>c</b>, Scatter plot of the correlation in PacBio long-read gene expression (log<sub><span face="微軟正黑體, sans-serif" lang="EN-US"><span style="font-size: xx-small;">10</span></span></sub> TPM + 1) between Cortex1 and Cortex2. Pearson correlation (<i>r</i>) is indicated.</span></td></tr></tbody></table><div><br /></div><div><br /></div><b><i><span style="color: #6aa84f;">3. 自閉症之外顯子表現 ( alternative usage of single exons ) 隨細胞類型而異</span></i></b><div><br /></div>由 SnISOr-Seq 單細胞分析找出不同基因編輯結果,從不同細胞群觀察到同一基因編輯位點的發生率 ( Ψ ) 彼此不同 <span style="color: #ffa400;">( Fig 3a )</span>,發現不同細胞類型間的高機率基因剪切 ( variability:ΔΨ > 0.75 ) 常出現在 microexons ( 長度 < 27nt ) 與長度兩倍 ≤ 54nt 的 exon <span style="color: #ffa400;">( Fig 3b )</span>,而這種細胞類型高相關度的外顯子表現變動性 ( cell-type-specific exon inclusion ),可以檢視尋找是否發生在疾病相關 exon,以搜尋疾病關聯的細胞類型。研究團隊接著蒐集了三種神經性疾病 — 精神分裂症 ( Schizophrenia )、漸凍人症 ( Amyotrophic lateral sclerosis, ALS )、自閉症 ( Autism spectrum disorder, ASD ) — 的已知相關 exon 變異,雖然 Schizophrenia 與 ALS 的已知 exon 變異,與前述實驗所得的 cell-type-specific exon inclusion 間沒有顯著關係,但在 ASD 發現該 exon inclusion 現象,與已知的致病 exon 有明顯關聯 <span style="color: #ffa400;">(</span> P < 2.22 e−16, <span style="color: #ffa400;">Fig 3c )</span>。在有 exon inclusion 現象的 ASD 相關基因中,<i>CADM1</i> 具有多重、高度 cell-type-specific 的變動性 exon,它的 Alt. exon3 為 ASD 疾病相關,並在 ASD 相關細胞間 — 星形膠質細胞 ( astrocytes ) 及寡突膠質類型細胞 ( oligodendrocyte precursor cells, OPCs; oligodendrocytes ) 有不同的 exon inclusion 表現,暗示其可能為自閉症更相關的潛在研究目標 <span style="color: #ffa400;">( Fig 3d )</span>。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEj56k_aZZPOoFLy5h0_jivlmBW0fammaIc5e1f4QNh558QhWS2mr7bhfZrQ6Id0JVMT0ruTFRKdX11pDxj7PVFEmDlQtP8m6dzAsBzKMxNc-AtUDDiYzbvxExyTyLjP5Q16-ZUmPvLAWwd1dy7li4yfrX5rhJvW9Vwq6T_eepGphWsOlBNTDhD479Cp/s800/PIC_3.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="702" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEj56k_aZZPOoFLy5h0_jivlmBW0fammaIc5e1f4QNh558QhWS2mr7bhfZrQ6Id0JVMT0ruTFRKdX11pDxj7PVFEmDlQtP8m6dzAsBzKMxNc-AtUDDiYzbvxExyTyLjP5Q16-ZUmPvLAWwd1dy7li4yfrX5rhJvW9Vwq6T_eepGphWsOlBNTDhD479Cp/s16000/PIC_3.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><b>Fig 3: Alternative usage of single exons.</b><br /><span style="color: #999999;"><b>a</b>, Schematic illustrating percent spliced-in (<i>Ψ</i>) calculation for an alternative exon (green). The exon shows different levels of inclusion across three cell types, with variability defined as max<i>Ψ</i> − min<i>Ψ</i>. <b>b</b>, Density plot of the exon variability across the four major cell types and exon length on the <i>x</i> axis. Colors indicate the discrete categories of variability. <b>c</b>, Box plots of the exon variability for alternative disease-associated exons (red) compared to alternative exons with no known association with that disease (green). <i>P</i> values obtained from a two-sided Wilcoxon rank-sum test. Investigated diseases are represented on the <i>x</i> axis (<i>n</i> = 46; 1,580; 69; 1,557; 227; and 1,399 exons). <b>d</b>, Full-length transcript expression by cell type for the <i>CADM1</i> gene. Each horizontal line indicates one transcript, colored by cell type; clustered blocks denote exons. Black denotes annotated GENCODE transcripts. Purple boxes highlight three alternative exons: AE1–AE3. For box plots: center line, median; box limits, upper and lower quartiles; and whiskers, 1.5× interquartile range.</span></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><b><i><span style="color: #6aa84f;">4. 神經細胞的外顯子配對協同性 ( Exon coordination )</span></i></b><div><br /></div>為了解基因是如何選擇性的使用 exon 產生豐富多樣的 isoforms,先由 exon 間的外顯子配對協同性 ( Exon coordination ) 來觀察 exon 間的組合變化。研究團隊先將數據去掉單細胞標記,成為 " 模擬混細胞數據 " ( pseudo-bulk level ),發現相鄰的外顯子 ( Adjacent exon ) 比遠端外顯子 ( Distant exon ) 有較強的配對協同性一起組成 isoform <span style="color: #ffa400;">( Fig 4e )</span>。數據顯示 Distant exon 經常呈現配對互斥性 <span style="color: #ffa400;">(</span> mutual exclusion, <span style="color: #ffa400;">Fig 4a,i)</span>,但互斥性幾乎未於 TSS / polyA site 出現 <span style="color: #ffa400;">( Fig 4j )</span>。接著進行單細胞類型間的外顯子配對協同性計算,結果未能獲得統計顯著性,而研究團隊歸因於單細胞層級的序列變少導致數據不足,以及遠端外顯子的特異性配對 ( Distant alternative exon pairs )。數據中可以看到 Distant alternative exon pairs 較近端高出約 2 倍 <span style="color: #ffa400;">( Fig 5c )</span>,並於每種神經細胞類型中都有觀察到 <span style="color: #ffa400;">( Fig 5d )</span>。另外,研究團隊也發現 ASD 疾病相關的 exon 間,也具有顯著的配對協同性 <span style="color: #ffa400;">( Fig 5e )</span>,像是 <i>PTK2</i> 基因在不同細胞類型間 microexon 的 exon pair ( 外顯子配對表現 ) <span style="color: #ffa400;">( Fig 5f )</span>。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgtdOx9HldARG0flCcrsu6_b6M1G2Oz-X9k-LJ8ayDmmJGNmntcpS7o1c34nhGtjr9ADwt7eckTfb-FGcOrKepJ-3ZmaKKHa6djLvePvB1DAi24cCDhQzUg_cyXvmi_lBvmTk3emWudsMj0mTx79mTzlIlWiW05Bo986I2scNmtiMMVS9ryImCmWX-k/s800/PIC_4.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="536" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgtdOx9HldARG0flCcrsu6_b6M1G2Oz-X9k-LJ8ayDmmJGNmntcpS7o1c34nhGtjr9ADwt7eckTfb-FGcOrKepJ-3ZmaKKHa6djLvePvB1DAi24cCDhQzUg_cyXvmi_lBvmTk3emWudsMj0mTx79mTzlIlWiW05Bo986I2scNmtiMMVS9ryImCmWX-k/s16000/PIC_4.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><br /><b>Fig. 4: Coordination of adjacent and distant exon pairs.<br /></b><span style="color: #999999;"><b>a</b>, Schematic showing types of exon coordination patterns when considering two alternative exons (red). Mutual inclusion (top) and mutual exclusion (bottom) of distant and adjacent alternative exons. <b>e</b>, Box plots of the |log-odds ratio| for significant genes on the y axis plotted against adjacent (<i>n</i> = 236) and distant (<i>n</i> = 25) exon pairs seen in <b>b</b> and <b>c</b> on the <i>x</i> axis. <b>i</b>, Scatter plot of the |log-odds ratio| of coordination for exon pairs tested for association versus the minimum primate PhastCons score from the exon pair. <b>j</b>, Scatter plot of the ΔΠ versus the minimum PhastCons score among the TSSs (left) and polyA sites (right) associated with an exon. Regression lines <b>(i, j)</b> with 95% confidence interval obtained using the loess fit. <i>P</i> values <b>(e, g, h)</b> obtained from two-sided Wilcoxon rank-sum test. <i>P</i> values <b>(i, j)</b> from two-sided Pearson's product moment correlation statistic. Significance: *<i>P</i> < 0.05; **<i>P</i> < 0.005; ***<i>P</i> < 0.001; NS, not significant. For box plots: center line, median; box limits, upper and lower quartiles; and whiskers, 1.5× interquartile range. VLMC, vascular lepotomeningeal cell.</span></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEihOSF5ZChbLHYWmdpZfMbFVdxGCfLgSu5ZvbJ_kEwU2P8Rm25iKO8IMpoO2Oexd93LNsDO5XOQ1qaSAwrGgHJ0W6J70zPM7Re2TxrnXaBZ-bB0NYacFD4WNV9CHDRj5LowQTwMtJF49RZl5dgQyfh5z0equYF1mld6xqxlqDkeH-ufVLcv7hyOtvpq/s814/PIC_5.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="814" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEihOSF5ZChbLHYWmdpZfMbFVdxGCfLgSu5ZvbJ_kEwU2P8Rm25iKO8IMpoO2Oexd93LNsDO5XOQ1qaSAwrGgHJ0W6J70zPM7Re2TxrnXaBZ-bB0NYacFD4WNV9CHDRj5LowQTwMtJF49RZl5dgQyfh5z0equYF1mld6xqxlqDkeH-ufVLcv7hyOtvpq/s16000/PIC_5.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><b>Fig 5: Exon coordination patterns are observable across multiple cell types.</b><br /><span style="color: #999999;"><b>c</b>, Bar plots of percentage of genes that are not testable in any cell type because at least one exon became constitutive. x axis values indicate adjacent (<i>n</i> = 114) or distant (<i>n</i> = 23). <b>d</b>, Bar plots of percentage of genes that are not testable in specific cell types because at least one exon became constitutive, colored by adjacent (<i>n</i> = 31, 31, 26, 26 and 22) or distant (<i>n</i> = 15, 15, 15, 15 and 14) exon pairs. <b>e</b>, Bar plot showing percent of distant coordinated exon pairs split by ASD association (<i>n</i> = 67 and 241). <i>P</i> value obtained from two-sided Fisher's exact test. <b>b–e</b>, Error bars indicate s.e. of the point estimate. <b>f</b>, Distantly coordinated exons for the <i>PTK2</i> gene. Each horizontal line indicates one transcript, colored by cell type; clustered blocks indicate exons. Gray denotes annotated GENCODE transcripts. Blue boxes highlight coordinated exons, labeled Alt. exon 1 and Alt. exon 2. Control exon for qRT–PCR highlighted in blue.</span></td></tr></tbody></table><br /><br /><b><i><span style="color: #6aa84f;">5. 神經細胞的外顯子-TSS、外顯子-polyA 間配對協同性</span></i></b><div><br /></div>除了基因的 exon-exon coordination 外,研究團隊接著分析 exon-Transcription start site ( TSS ) 間、exon-polyA site 之間的調控是否也存在細胞類型特異的配對協同性 ( exon- TSS、exon-polyA coordination )。研究團隊在 5 種主要的神經細胞間只觀察到部分的 TSS – exon coordination。相對於 adjacent exon 的配對協同,5 種神經細胞的 TSS 或 exon 都有自己的細胞特定常用 ( constitutive ) 偏好 <span style="color: #ffa400;">( Fig 6c )</span>, 而 exon-polyA 與 exon-TSS 兩者的協同表現則具有相似的常用偏好 <span style="color: #ffa400;">( Fig 6f )</span>。以 <i>BOD1L1</i> 為例,<i>BOD1L1</i> 有兩個主要的 polyA sites,當 downstream polyA site 使用時,前面會剪切出較短的 exon;當 upstream polyA site 使用時,則主要會產生較長的 exon。這個現象在 " 模擬混細胞數據 " ( pseudo-bulk ) 與 excitatory neurons ( 興奮性神經元 ) 中出現,但在 inhibitory neurons ( 抑制性神經元 ) 中則會是常態產生較長的 exon。概括來看,exon-polyA coordination 只在 " 模擬混細胞數據 " 與 " 興奮性神經元 " 中出現。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEivnxFGx4og0LBaiIWf_YgCcde4PlIyVm7SCA814pJT_xHbA5SQQsNoYb7LNb4FcDo0G3NuOHnKvoSmqyNRvDgG7YakarNT_ZKIKGdK-MqyqNFqbyFlRI2m0DGzooEhmUGjtP9hSemF7qYQV4jC27D03l1KbrYgJSN8JPakcux7XCysWO-kyPfB24MJ/s902/PIC_6.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="902" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEivnxFGx4og0LBaiIWf_YgCcde4PlIyVm7SCA814pJT_xHbA5SQQsNoYb7LNb4FcDo0G3NuOHnKvoSmqyNRvDgG7YakarNT_ZKIKGdK-MqyqNFqbyFlRI2m0DGzooEhmUGjtP9hSemF7qYQV4jC27D03l1KbrYgJSN8JPakcux7XCysWO-kyPfB24MJ/s16000/PIC_6.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><br /><b>Fig. 6: Exon–end site coordination is mediated by individual cell types.</b><br /><span style="color: #999999;"><b>c</b>, Heat map showing cell types as columns and exon–TSS pairs as rows (<i>n</i> = 66). Each element of the heat map is colored by whether the exon–TSS pair showed significant coordination (pink), was not significant (white) or was not testable because of low counts (gray) or because an exon or TSS became constitutively included in a cell type (teal). <b>f</b>, Heat map showing cell types as columns and testable exon–polyA sites as rows (<i>n</i> = 80). Each element of the heat map is colored as in <b>c</b>. <b>g</b>, Full-length transcript expression broken down by cell type for the <i>BOD1L1</i> gene. Each horizontal line is one transcript; clustered blocks indicate exons. Gray denotes annotated GENCODE transcripts. Purple boxes highlight region of interest. Astro, astrocyte; EN, excitatory neuron; IN, inhibitory neuron; Oligo, oligodendrocyte.</span></td></tr></tbody></table><div><br /></div><div><br /></div>RNA transcripts 具有許多的 gene element ( TSS, exon, intron, polyA… ) 組合,梳理這些組合特徵有助於了解複雜生物全貌。過去的二代 RNA-seq 只能提供混合、片斷化後的結果。而一般的三代 scRNA-seq 又會讀到許多 intron 片段 <span style="color: #ffa400;">( Fig 1b, 1c )</span>,除了降低大量可用數據外,高雜訊也使 gene isoform 研究複雜化。SnISOr-Seq 透過 SureSelect V8 去除單細胞 RNA 全長文庫中的汙染序列,有效保留功能性 RNA isoform 進行後續三代定序,大幅提升三代數據中的有效比例達 7.5 倍。此外,SnISOr-Seq 系統將單細胞技術與三代定序結合活用在腦部額葉的外顯子研究中,發現自閉症相關基因外顯子的配對協同性與細胞類型特異性,往後面對複雜的組織、或難以分離的樣本類型,可利用三代定序與單細胞技術進行合適的基因分析,不但跨越讀長限制,且能從中擷取到生物最小單位 — 細胞個體的特性,獲得細微而完整、全長的 RNA 訊息,也為下一步全面性的蛋白質體分子解析奠下基礎。<div><br /></div><div><br /></div><br /><span style="color: #ffa400;"><b>【參考資料】</b></span><div> 1. <a href="https://mail.surenotifyapi.com/v1/t/c?s=2&x=20220713054319-1-0a61537b-4689-42aa-9d4e-08b72fc2a0fb">https://www.nature.com/articles/s41587-022-01231-3#MOESM1</a></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-79941354868205038012022-07-01T12:00:00.000-07:002022-07-12T23:41:53.007-07:00韓國三星醫療中心 NHL 惡性淋巴瘤 TMB 評估與診斷Lymphocytes ( 淋巴球 ) 為 T 細胞、B 細胞、NK 細胞 ( 自然殺手細胞 ) 等不同作用的白血球所組成,其惡性病變稱為惡性淋巴瘤 ( malignant lymphoma )。惡性淋巴瘤分為 Hodgkin Lymphoma ( 何杰金氏淋巴瘤, HL ) 和 Non-Hodgkin Lymphoma ( 非何杰金氏淋巴瘤, NHL ) 兩種。Hodgkin Lymphoma 源於 mature B-cell ( 成熟 B 細胞 ) 惡化而來的 Reed-Sternberg cells,Reed-Sternberg cells 異常大顆且細胞核超過一個。Non-Hodgkin Lymphoma ( NHL ) 則源於 B 細胞或 T 細胞,NHL 可以擴散到淋巴結裡,也能轉移到其它器官。兩者的病理型態學及臨床表現具有差異。西方人常見 Hodgkin Lymphoma ( HL ),預後較好。東方人較多 Non-Hodgkin Lymphoma ( NHL ),發生率為 HL 的 9 倍。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjg3017HODVJ94e62L1jumUPUnKxFrIWJHVQGw6oisp_DaVbniiH63eVJ52TiK4BUu2KkDKyuQFDxNr6xO9qaz_DooChJI4Dx9yOyWdB7sg2_dDKacfzg7SsCG-_ye9Ge231qp3XJ2d3qg94HNZKBWrpU2or9Sk2D4V_aqE5x5xos3hY6ALhHxMkpjs/s800/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="456" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjg3017HODVJ94e62L1jumUPUnKxFrIWJHVQGw6oisp_DaVbniiH63eVJ52TiK4BUu2KkDKyuQFDxNr6xO9qaz_DooChJI4Dx9yOyWdB7sg2_dDKacfzg7SsCG-_ye9Ge231qp3XJ2d3qg94HNZKBWrpU2or9Sk2D4V_aqE5x5xos3hY6ALhHxMkpjs/s16000/PIC_1.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><div style="text-align: left;">圖一、何杰金氏淋巴瘤 ( Hodgkin lymphoma, HL ) 與 Reed-Sternberg cell</div><div style="text-align: left;"><span style="color: #999999;">圖片取自 Dana-Farber Cancer Institute 霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的区别是什么? <b>LYMPHOMA DIFFERENCES</b></span></div></td></tr></tbody></table><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh-siDwe9c3HOL9-i5XLcTHfPlsbVPoEH1qPeu9W2mDpk80b3WojRc5KTO1cjvKniNeh349iZHAYuYiR4ubUhRYiHxWfOQ5Cax5OLkudFzbcR5p5ld0CB6c3IeMgdnyLfyyZjsQb65OD6KFM1eR-Ly9tRJNXvI9kJadFm79M_r7WY7HuucW3p0Ci59r/s800/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="274" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh-siDwe9c3HOL9-i5XLcTHfPlsbVPoEH1qPeu9W2mDpk80b3WojRc5KTO1cjvKniNeh349iZHAYuYiR4ubUhRYiHxWfOQ5Cax5OLkudFzbcR5p5ld0CB6c3IeMgdnyLfyyZjsQb65OD6KFM1eR-Ly9tRJNXvI9kJadFm79M_r7WY7HuucW3p0Ci59r/s16000/PIC_2.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><div style="text-align: left;">圖二、Non-Hodgkin lymphoma ( NHL ) 圖例 - 彌漫性大 B - 細胞淋巴瘤 ( diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL )、濾胞性 B - 細胞淋巴瘤 ( follicular lymphoma ) 及 T 細胞淋巴瘤</div><div style="text-align: left;"><span style="color: #999999;">圖片取自香港防癌會-淺談淋巴瘤</span></div></td></tr></tbody></table><br />Non-Hodgkin Lymphoma ( NHL ) 主要分為 B 細胞淋巴瘤、T 細胞淋巴瘤及 NK / T 細胞淋巴瘤三大類,其中 B 細胞淋巴瘤佔美國的 NHL 達 9 成,主要為彌漫性大 B - 細胞淋巴瘤 ( diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL ) 及濾胞性淋巴瘤 ( follicular lymphoma ),NK / T 細胞淋巴瘤則較罕見。大部份 Non-Hodgkin Lymphoma 的 B 細胞淋巴瘤細胞表面具有 CD20 獨特抗原,該抗原已有 Rituximab 單株抗體 ( monoclonal antibody, mab ) 可進行免疫治療,它也能與其他化療藥物結合運用,Rituximab 及化學治療的結合運用,已成為 B - 細胞淋巴瘤的重要治療法。<br /><br />腫瘤突變負荷 ( tumor mutation burden, TMB ) 為新興的癌症重要評估指標之一,TMB 可應用於免疫治療的反應性評估 <span style="color: #ffa400;">( 關於 TMB 在精準醫療的進展與應用,請看:</span><a href="https://welgene.blogspot.com/2022/04/fda-wes-tmb.html">美國 FDA WES TMB 標準化 加速免疫治療應用與發展</a> <span style="color: #ffa400;">)。</span> TMB 數值與癌細胞的 DNA 突變數量相關,TMB 數值越大、蛋白質突變數越多,免疫治療反應性可能越佳,因此,TMB 成為癌症個人化治療的重要評估數值,許多臨床檢測、治療開發,都會比較不同臨床型態患者的 TMB 數值,評估是否能以 TMB 來作為治療依據。<br /><br />韓國首爾三星醫療中心 ( Samsung Medical Center ) 於 2019 - 2020 年以 SureSelect custom cancer gene panel 進行 300 位 non-Hodgkin lymphoma 患者 NGS 檢查,驗證 TMB 數值與免疫療法的關聯,相關資訊如下:<br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">● 分析方法</span></b><br /><br />根據先前該單位血液科惡性疾病 ( hematologic malignancies ) 檢測內容基礎,加強 non-Hodgkin lymphoma 相關基因,設計出 SureSelect NHL 405 gene panel 進行 NGS 分析,找出患者所帶有的 SNV / Indel 突變作為 TMB 數值依據,並比對相關臨床表徵診斷。<br /><br /><div><div><span style="color: #6aa84f;"><b>● 分析結果</b><br /></span><br /><b><i>( 1 ) 突變變異頻率分布</i></b><br /><br /><div>VAF ( variant allele frequency, <b>變異頻率</b> ) 在 39 - 52% 之間出現數量最多 ( Green Bar ),這個 VAF 區段跟遺傳性 SNV 的可能 VAF% 值重疊。將 VAF <5% 且 total read <100 的突變排除後,整體的 SNV / Indel 平均數量為 22.68 ( 6804 / 300 )。<div><b><i><br /></i></b></div></div><div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi0hF8F5qe3NABMo3fgDi1bKpYPc2BxAKaSigW5g4Z_qRCyuw_shXOrs0n6fHO1cLaH5kX7cBDauTwz3pSXXGclZ5fC5ZEB85VpYfooPqrNZlBizjLkjUl_SWg4Yzw_gByVnfgu_XecpjyJdCTUZRqd7KNkbgoWdtG6WcjWvlRwk_NggV-xiSEPAoFG/s800/PIC_3.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="442" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi0hF8F5qe3NABMo3fgDi1bKpYPc2BxAKaSigW5g4Z_qRCyuw_shXOrs0n6fHO1cLaH5kX7cBDauTwz3pSXXGclZ5fC5ZEB85VpYfooPqrNZlBizjLkjUl_SWg4Yzw_gByVnfgu_XecpjyJdCTUZRqd7KNkbgoWdtG6WcjWvlRwk_NggV-xiSEPAoFG/s16000/PIC_3.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">Figure 1. Number of SNV/Indel according to variant allele frequency in 300 cases. <span style="color: #999999;">Red bars are the section with variant allele frequency less than 5%. Green bars are the section estimated to contain lots of germline mutations.</span></td></tr></tbody></table><br /><br /><b><i>( 2 ) 腫瘤細胞分群的突變量分布</i></b><br /><br />接著比對不同免疫細胞間的 SNV / Indel 突變數 ( TMB 計算基礎 ),先以最基本的 mature B-cell、mature T-cell neoplasms 區別來計算平均突變數,得到 mature B-cell neoplasm 平均 23.98、mature T-cell neoplasm 平均 17.21,具有 P < 0.001 顯著差異的結果 <span style="color: #ffa400;">( Figure 2A )</span>。接著細分不同類型,瀰漫性大 B 細胞淋巴瘤 ( diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL ) 包含最多突變數,其次為 B 細胞腫瘤 ( Mature B-cell lymphoma ),再者是 T 細胞 / NK 細胞腫瘤 ( Mature T-/NK-cell lymphoma )。接著觀察各類免疫淋巴瘤 SNV / Indel 裡 VAF 在 39-52% 的佔比,顯示雖然各類免疫淋巴瘤的總 SNV / Indel 數量有高低差異,但 VAF 39-52% 這群的數量相對一致無顯著差異 <span style="color: #ffa400;">( Figure 2B )</span>,有很大的機率是遺傳性 Germline mutations。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhZ0-BXxMjBeLnuSuiOVhksbdCZNdyy2n9UWpe89SvR7JQwZ3pnp7ciL2fCWGk1WWXdUWd_tXDzeDLz56yztXO5GeMBEBVkgasDOXUXkrUqwxoYVRUcrFMD5QqeSBka23hGyfHlstp016GWsPn8_rgdyK56N32nU2kye47vwvdGPuGvvB5T0ckcDE-I/s1273/PIC_4.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="1273" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhZ0-BXxMjBeLnuSuiOVhksbdCZNdyy2n9UWpe89SvR7JQwZ3pnp7ciL2fCWGk1WWXdUWd_tXDzeDLz56yztXO5GeMBEBVkgasDOXUXkrUqwxoYVRUcrFMD5QqeSBka23hGyfHlstp016GWsPn8_rgdyK56N32nU2kye47vwvdGPuGvvB5T0ckcDE-I/s16000/PIC_4.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">Figure 2. (A) Scatter plot of number of SNV/Indel for all cases. <span style="color: #999999;">The horizontal bar represents the median value. </span>(B) Bar graph in which the number of SNV/Indel is arranged in the order of median value.</td></tr></tbody></table><br /><br /><b><i>( 3 ) 臨床癌症分期與診斷</i></b><br /><br />依前述三淋巴瘤類群,分析不同類群的突變量,與臨床癌症分期關係 <span style="color: #ffa400;">( Figure 3B, 4B, 5B )</span>、病情、或診斷狀態 <span style="color: #ffa400;">( Figure 3C, 4C, 5C )</span>。不同類型的淋巴瘤有不同的突變數量,可能可以反應腫瘤的不同臨床病理特徵。利用 SNV / Indel ( 或 TMB ) 數值再搭配其他的 biomarkers,未來是有機會協助臨床選擇醫療策略。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjUXCV-Uc0OEWLeqTZD21WssNbyDYUTVLwN7NGWaQLzSwzmDEey4cQUgD7FcDlM4pFzp52ivG9k38yvrHyYQOJmTOQrqRSQPdQ0K_aklAYw-7VhpKqGDg-sACNgwePdlsFEk8eEhXMYheJsUA0aJDGKQNrNQOCnPhODSJvLLX_MVR1Q_E7h4awZ9J_q/s800/PIC_5.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="395" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjUXCV-Uc0OEWLeqTZD21WssNbyDYUTVLwN7NGWaQLzSwzmDEey4cQUgD7FcDlM4pFzp52ivG9k38yvrHyYQOJmTOQrqRSQPdQ0K_aklAYw-7VhpKqGDg-sACNgwePdlsFEk8eEhXMYheJsUA0aJDGKQNrNQOCnPhODSJvLLX_MVR1Q_E7h4awZ9J_q/s16000/PIC_5.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><br />Figure 3. (B) SNV/Indel numbers of DLBCL variants compared by Ann-Arbor stage. (C) SNV/Indel numbers of DLBCL variants between tumors at diagnosis and relapsed/refractory tumors.<br /><span style="color: #999999;">DLBCL (diffuse large B-cell lymphoma); CNS (central nervous system); NOS (not otherwise specified); GCB (germinal center B-cell); ABC (activated B-cell); MALT (mucosa-associated lymphoid tissue); EBV (Epstein-Barr virus); PMLBL (primary mediastinal large B-cell lymphoma); HGBCL (high-grade B-cell lymphoma)</span><br /><br />Figure 4. (B) SNV/Indel numbers of mature B-cell lymphoma except DLBCL variants compared by Ann-Arbor stage. (C) SNV/Indel numbers of mature B-cell lymphoma except DLBCL variants between tumors at diagnosis and relapsed/refractory tumors.<br /><span style="color: #999999;">MALT (mucosa-associated lymphoid tissue); CLL/SLL (chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma); FL (follicular lymphoma); MALToma (extranodal marginal zone lymphoma of MALT); MCL (mantle cell lymphoma); LPL (lymphoplasmacytic lymphoma); NMZL (nodal marginal zone lymphoma)<br /></span><br />Figure 5. (B) SNV/Indel numbers of T- and NK-cell lymphomas compared by Ann-Arbor stage. (C) SNV/Indel numbers of T- and NK-cell lymphoma between tumors at diagnosis and relapsed/refractory tumors.<br /><span style="color: #999999;">PTCL (peripheral T-cell lymphoma); NOS (not otherwise specified); TFH (T follicular helper cell); ALCL (anaplastic large cell lymphoma); ALK (anaplastic lymphoma kinase); ENKTL (extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type); AITL (angioimmunoblastic T-cell lymphoma); FTCL (follicular T-cell lymphoma)</span></td></tr></tbody></table><br /><br />Whole exome sequencing ( WES ) 雖為癌症 TMB 測量的標準方法,但臨床診斷需要更快速、經濟的做法,此研究結果顯示精確設計的小型 gene panel,除了能針對關鍵突變進行檢測,獲得更有效益、協助診斷的結果外,也可以獲得合理的 TMB 數值,進行下一步臨床應用研究。<div><br /></div><div><br /></div><div><br /></div><span style="color: #ffa400;"><b>【參考資料】</b></span><br /><span style="color: #999999;">( Dana-Farber Cancer Institute )</span><br />1. <a href="https://www.dana-farber.org/non-hodgkin-lymphoma/about/">https://www.dana-farber.org/non-hodgkin-lymphoma/about/</a><br />2. <a href="https://www.dana-farber.org/for-patients-and-families/becoming-a-patient/international-patients/chinese/inspiration/%E9%9C%8D%E5%A5%87%E9%87%91%E6%B7%8B%E5%B7%B4%E7%98%A4%E5%92%8C%E9%9D%9E%E9%9C%8D%E5%A5%87%E9%87%91%E6%B7%8B%E5%B7%B4%E7%98%A4%E7%9A%84%E5%8C%BA%E5%88%AB%E6%98%AF%E4%BB%80%E4%B9%88--lymphoma-differences/">https://reurl.cc/vdEyGL</a><br /><br /><span style="color: #999999;">( 財團法人台灣癌症基金會 )</span><br />3. <a href="https://www.canceraway.org.tw/page.php?IDno=2223">https://www.canceraway.org.tw/page.php?IDno=2223</a><br /><br /><span style="color: #999999;">(香港防癌會-淺談淋巴瘤)</span><br />4. <a href="https://www.hkacs.org.hk/ufiles/Lymphoma.pdf">https://www.hkacs.org.hk/ufiles/Lymphoma.pdf</a><br /><br />5. <a href="https://bmccancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12885-021-08695-7">https://bmccancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12885-021-08695-7</a></div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-83611428698238856162022-06-06T00:00:00.000-07:002022-06-06T23:36:14.025-07:00子癲前症 plasma cell free RNA ( cfRNA ) 研究的 SureSelect 應用<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjfXvaRfs4vyA_0m6jTvbLjIVBkTx74llT0AE0BeqIlk0CnOB7UEAaXgP8kMq2cbmWEWlKXt2Gei0-JFntaNpVfZTlI1gzST3_QSXPKDM7Bw1-U0KA_M1qYh8cM2EWKx4iOfHn9PlsBd7j3ezyaqTeSCtHP4z2qD4VjqP8xSNboTfZ4neGoSJfqYfMp/s800/BLOG.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="315" data-original-width="800" height="158" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjfXvaRfs4vyA_0m6jTvbLjIVBkTx74llT0AE0BeqIlk0CnOB7UEAaXgP8kMq2cbmWEWlKXt2Gei0-JFntaNpVfZTlI1gzST3_QSXPKDM7Bw1-U0KA_M1qYh8cM2EWKx4iOfHn9PlsBd7j3ezyaqTeSCtHP4z2qD4VjqP8xSNboTfZ4neGoSJfqYfMp/w400-h158/BLOG.jpg" width="400" /></a></div><div><br /></div>液態活檢 ( liquid biopsy ) 技術,已成功應用在 DNA 層次的臨床檢測中,像是癌症突變或非侵入式母血唐氏症篩檢,然而 cfRNA 因技術與分析方法具更高門檻,因此未成為檢測的主流標的。近來在 RNA exome 抓取技術的進步下,FFPE、cell free 挑戰性 RNA 樣品的基因表現 ( expression )、RNA fusion 偵測等已能輕鬆完成,而 cfRNA 也逐漸成為新的檢測開發目標。2022 年 1 月 Nature 期刊發表了 cfRNA 於妊娠子癲前症預測的臨床研究,由美國懷孕併發症預測平台 — Mirvie 公司與 Brigham and Women's Hospital ( BWH, 哈佛醫學院主要教學醫院之一、Dana-Farber 癌症研究所合作醫院 ) 合作,針對懷孕惡性風險極高的子癲前症,獲得了高度可行的 cfRNA 臨床成果。<br /><br /><div>子癲前症發生率約 2 – 8% <a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3871181/" target="_blank">1</a>,產婦出現高血壓合併蛋白尿等症狀,主要是胎盤功能不良所致,使胎兒生長遲緩、早產,嚴重則可能有致死風險,根據統計,是造成台灣產婦、胎兒死亡的三大主因之一 <a href="https://www1.cgmh.org.tw/intr/intr2/c4710/contents/m/38-4.htm" target="_blank">2</a>。因此 Mirvie 與 BWH 合作收集了橫跨 5 - 40 妊娠週數的 1840 位不同種族、國籍、地區、社經狀態的孕婦,共 2539 個 plasma 樣品 <span style="color: #ffa400;">( Fig. 1a )</span>,進行懷孕期間的子癲前症母血 cfRNA 基因表現分析,相關研究內容為:<br /><br /><br /><b><span style="color: #6aa84f;">● 樣本收集與處理</span></b><br /><br />自每個樣本 0.215 – 1 mL 的 plasma 萃取 cfRNA 並純化之,使用 Agilent SureSelect 系統進行 RNA capture、建庫、定序。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhBxrzblmLZtzDBTvotMmRkPNjujE11OBSWl41pfqo8Dc7C9WRM4HjIMPMoeuVcACs6Kk--qSnI14oBRHbUa5n2ZPFUwLZyhGyVArUXB6UFAgKiRoLauXP9266vA-iqa2wlI74GEz0E-G0lH1BqI28W3gKUuZmcZEEo7NuNIcm2BWzw5Fs_-hAQ4Mtz/s815/PIC_1.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="815" data-original-width="800" height="640" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhBxrzblmLZtzDBTvotMmRkPNjujE11OBSWl41pfqo8Dc7C9WRM4HjIMPMoeuVcACs6Kk--qSnI14oBRHbUa5n2ZPFUwLZyhGyVArUXB6UFAgKiRoLauXP9266vA-iqa2wlI74GEz0E-G0lH1BqI28W3gKUuZmcZEEo7NuNIcm2BWzw5Fs_-hAQ4Mtz/w628-h640/PIC_1.png" width="628" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><br />【Fig 1. Overview of plasma sampling and cohorts and gestational age modelling.】<br /><br /><span style="color: #999999;"><b>a</b>, Cohorts are labelled A–H (Table 1). Circles represent plasma samples from liquid biopsies (n = 2,539). Colours represent the race of the maternal donor. <b>b</b>, Model predictions from the hold-out test (n = 474) using cfRNA transcript data in the Lasso linear model versus ultrasound-predicted gestational age. The dark grey zone represents 1 s.d., and the light grey zone represents 2 s.d. <b>c</b>, Variance explained from ANOVA.</span></td></tr></tbody></table><div><br /></div><br /><b><span style="color: #6aa84f;">● 研究結果</span></b><div><br /></div><b><i>1. cfRNA 的孕齡 / 胎齡預測模型</i></b><br /><br /><div>研究團隊以 Lasso linear model 建立 cfRNA 的妊娠週數機器學習模型,cfRNA 數據先依妊娠週數區分並做基因表現量正規化,再將 2,539 個 cfRNA 分為 training set ( n=1,908 ) 及 test set ( n=4,74 ) 兩組,進行胎兒特定週數的對應基因表現模型訓練,結果顯示模型 ( Gestational age model ) 與超音波預測的第二、第三孕期結果相當 <span style="color: #ffa400;">( Fig 1b )</span>,可作為懷孕婦女產前檢查另一種新的檢測方式。此妊娠週數預測模型幾乎只與 cfRNA 訊號有關,不受產婦種族、年齡、BMI 等變數影響 <span style="color: #ffa400;">( Fig 1c )</span>。<br /><br /><br /><div><b><i>2. 孕期的生物表徵變化</i></b><br /><br /></div><div>cfRNA 表現特徵顯示了懷孕過程的基因動態變化,研究團隊試著探討母血中的 cfRNA 表現特徵主要是來自胎盤、胎兒、或子宮等相關來源。該團隊首先證實 cfRNA 中存在賀爾蒙分泌 ( gonadotropin and oestrogen pathways ) 相關基因,並且,資料庫中的胎盤主題基因群 ( gene sets ) 於 cfRNA 裡的占比也隨著孕程具有與 gestational age model 一致的增加趨勢 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2a,b )</span>,另外也看到母血 cfRNA 中數百組的主題基因群能映射胎兒生理變化。研究團隊特別應用了成人或胎兒器官的 single-cell RNA-seq 數據,確認了母血 cfRNA 中有胎兒相關基因群,像是胎兒心臟發育基因的表現變化 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2c )</span>;以及 cfRNA 能反應孕程中母體子宮 / 宮頸的膠原蛋白與 extracellular matrix ( ECM ) 基因群的增加 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2d )</span>。這些主題基因群,在不同人群類別 <span style="color: #ffa400;">( Tab 1 )</span> 中皆具有類似的妊娠週數 - 基因表現上升趨勢 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2e–h )</span>。<div></div></div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgRnOMmbbONkf70dKpRVNWWv-bl2QCjtr907fYUvtFFH-grgBILICfmUfHRsMI4-dP97jolApX-DOnID-tLdVeinRrUnwuma8hQqjIJ4oobz5S_z8RGX5jmGInJ94Qsj4ktdCjLAsunKTFICjmul5ksasBXi_NmRxEC2hz-YqnMIFT1CVHgS6Ty97JQ/s800/PIC_2.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="334" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgRnOMmbbONkf70dKpRVNWWv-bl2QCjtr907fYUvtFFH-grgBILICfmUfHRsMI4-dP97jolApX-DOnID-tLdVeinRrUnwuma8hQqjIJ4oobz5S_z8RGX5jmGInJ94Qsj4ktdCjLAsunKTFICjmul5ksasBXi_NmRxEC2hz-YqnMIFT1CVHgS6Ty97JQ/s16000/PIC_2.png" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><br />【Fig 2. Temporal profiles of pregnancy pathways for gene sets from the gestational age model and independently identified gene sets for placenta, developing fetal heart and collagen extracellular matrix known to be involved in uterus and cervix growth over gestation.】<br /><span style="color: #999999;"><br /><b>a–d</b>, Maternal plasma transcriptome fractions for gene sets averaged across all samples in each collection window. Gestational age model <b>(a)</b>, placenta <b>(b)</b>, developing heart <b>(c)</b> and collagen extracellular matrix (ECM) <b>(d)</b>. Error bars correspond to the 95% confidence interval around the mean. CPM, counts per million. n = 93 for each time point and gene set. <b>e–h</b>, Signal across all cohorts with longitudinal data: gestational age model <b>(e)</b>, placenta <b>(f)</b>, developing heart <b>(g)</b> and collagen ECM <b>(h)</b>. Linear fits are shown of transcriptome fractions for all samples across corresponding gestational ages recorded at collection times. The band around the solid line corresponds to the 95% confidence interval. All slopes for the gestational age coefficients are distinct from 0 at a confidence level of 0.05. Cohort is indicated by colour.</span></td></tr></tbody></table><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh3lUG2-GJn_w9SYepzUzM_Z8_XhFf4HZgkZgp9_MtRBoozCGdQ7MM5eTy7XCsj9SSS4dVOID0tV6rkLsjAnjzo1y_wRiXk7ReQjy4gtQEh7C7beUxDwLUYaObF4QplfjEY2dCvXTdte-UYY-0wwQu1SW4b0rH7PEMeiLYzfu5TUNHLH2kZyCxp3rFj/s800/PIC_3.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="260" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh3lUG2-GJn_w9SYepzUzM_Z8_XhFf4HZgkZgp9_MtRBoozCGdQ7MM5eTy7XCsj9SSS4dVOID0tV6rkLsjAnjzo1y_wRiXk7ReQjy4gtQEh7C7beUxDwLUYaObF4QplfjEY2dCvXTdte-UYY-0wwQu1SW4b0rH7PEMeiLYzfu5TUNHLH2kZyCxp3rFj/s16000/PIC_3.png" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【Tab 1. Sample Overview】</td></tr></tbody></table><br /><br /><div><b><i>3. cfRNA 的子癲前症早期預測</i></b><br /><br /></div><div>在確認 cfRNA 能顯現妊娠進程 ( 母體 — 胎盤 — 胎兒 ) 的分子變化特徵後 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2 )</span>,接著觀察第二孕期 ( 16 – 27周 ) 中是否有子癲前症造成的代謝途徑基因群 cfRNA 擾動。研究團隊以 case-control study 模式分析 cfRNA 數據,母血的採樣是從子癲前症尚無症狀的懷孕時期 ( 分娩前平均 14.5 周 ) 直至分娩 <span style="color: #ffa400;">( Fig 3a )</span>,而子癲前症的案例是由醫生基於 2013 年 Task Force on Hypertension in Pregnancy ( ACOG 2013 ) 進行診斷而來。交互計算後發現有 7 個基因 ( CLDN7、PAPPA2、SNORD14A、PLEKHH1、MAGEA10、TLE6、FABP1 ) 穩定的具有統計顯著性 <span style="color: #ffa400;">( Fig 3b )</span>。這些基因在數據群體子癲前症 13.7% ( 72陽 / 524例 ) 患病率下,具有 75% sensitivity ( 偵測靈敏度 )、32.3% PPV ( 陽性預測率, positive predictive value ) <span style="color: #ffa400;">( Fig 3c )</span>,此結果較目前方法學 4.4% PPV 為佳,並且不受母體 BMI、年齡、族群影響。另外在比對子癲前症 " 預測-陽性 ( test-positive ) "、" 預測-陰性 ( test-negative ) " 族群的分娩週數時,發現陽性個體存在顯著的早產現象 <span style="color: #ffa400;">( Fig 3d )</span>,母體血液 RNA 分析能於出現臨床徵兆的 3 個月多前檢出 73% 的早產案例,具有早期預測特性。</div></div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiQu81iNuLncvtC2lABmtBWPMB5u6QqahvPT0FeIdsPSxTRstHYt4JSiK2Yw-Dqh_GWI6S2SComS6AsHv2bnke-r5n5QF4gSNwTvnwwKLs0woXumGDFpOvRBwyZQmUL06wOO6fQBbeBF94IGjN079EwfcgvMXSEpN-b9sg81L8azFEv3U9VKuT0kGyM/s800/PIC_4.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="641" data-original-width="800" height="513" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiQu81iNuLncvtC2lABmtBWPMB5u6QqahvPT0FeIdsPSxTRstHYt4JSiK2Yw-Dqh_GWI6S2SComS6AsHv2bnke-r5n5QF4gSNwTvnwwKLs0woXumGDFpOvRBwyZQmUL06wOO6fQBbeBF94IGjN079EwfcgvMXSEpN-b9sg81L8azFEv3U9VKuT0kGyM/w640-h513/PIC_4.png" width="640" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><br />【Fig 3. Features and model performance for prediction of pre-eclampsia.】<br /><br /><span style="color: #999999;"><b>a</b>, Sample collection time (dashed lines) and delivery time (solid lines) for women with pre-eclampsia (purple and green) and controls (grey). Gradients illustrate timelines for developing pathophysiology and onset of clinical symptoms. <b>b</b>, Quantile–quantile plot of ranked Spearman P values for women with pre-eclampsia (cases) versus controls. P values were calculated from Spearman correlation on cohort-corrected data for each gene. The genes used in the model are labelled. The black dotted line represents the expectation. <b>c</b>, Receiver operating characteristic curve (mean and 95% confidence interval) for the logistic regression model for pre-eclampsia (n = 524). <b>d</b>, Kaplan–Meier curves of deliveries in test-positive and test-negative populations (n = 439), excluding spontaneous preterm deliveries.</span></td></tr></tbody></table><br /><br />這項研究除了收集了目前為止最大量、最多樣化的母體 cfRNA 數據,應用於來自不同種族婦女的產前檢查與預測,也顯示了 cfRNA 的 liquid biopsy 鑑別性,提供不受母體 BMI、年齡、族群影響的妊娠風險評估,並反應出疾病生理的進程。在未來 liquid biopsy 技術更加成熟後,其臨床追蹤的方便性,將能許多疾病在不同時間點對人體的影響,逐漸解析出臨床意義並進行預測,對於如產前檢測、晚發性遺傳疾病、癌症預後追蹤等,皆有極大幫助。這個 cfRNA 基因的研究開啟了新的醫學角度與治療契機,有望能降低產婦、新生兒的發病率和死亡率。<div><br /></div><div><br /></div><div><br /></div><b><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span></b><br />1. <a href="https://www.nature.com/articles/s41586-021-04249-w#Sec24">https://www.nature.com/articles/s41586-021-04249-w#Sec24</a><br />2. <a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3871181/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3871181/</a><br />3. <a href="https://www1.cgmh.org.tw/intr/intr2/c4710/contents/m/38-4.htm">https://www1.cgmh.org.tw/intr/intr2/c4710/contents/m/38-4.htm</a>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-88478113177666171072022-05-20T00:00:00.000-07:002022-05-22T17:59:07.440-07:00日本國家癌症研究中心醫院的 SureSelect 大腸癌 ( oligometastatic CRC ) cfDNA 研究應用<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhB-ZfTHC7ofxoZ8V8uKhaT8BgCoy6HAprSxvLkQr2MgWKFFI6JwSpgG0F_292d2bN_ARIpGhAfPD1IeGXNMNlH2rWGKLyZeQ_wgUP3Hk79DYcl3eGQRLoLFuZ8sG23W22cNpTYc0kHW9a2fYJUrm96xHPoh67Po3FGlNm0dBf3D_BgHvmoY3yv7Ikj/s800/Blog.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="534" data-original-width="800" height="214" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhB-ZfTHC7ofxoZ8V8uKhaT8BgCoy6HAprSxvLkQr2MgWKFFI6JwSpgG0F_292d2bN_ARIpGhAfPD1IeGXNMNlH2rWGKLyZeQ_wgUP3Hk79DYcl3eGQRLoLFuZ8sG23W22cNpTYc0kHW9a2fYJUrm96xHPoh67Po3FGlNm0dBf3D_BgHvmoY3yv7Ikj/s320/Blog.jpg" width="320" /></a></div><div><br /></div>液態活檢 ( liquid biopsy ) 近年興起,已逐漸成為分子檢測主流趨勢。得力於 NGS 的高靈敏度 ( 0.3-1% VAF ),它可在不取得原位組織檢體下,藉由分析受測者血液樣本中的游離 DNA ( cell free DNA, cfDNA ) 獲得重點突變評估,提供了一個採檢友善、非侵入性的替代性篩查法。同時此技術的偵測力隨著 NGS 定序量增加而有提升空間,此類篩檢已逐步應用於臨床 <a href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1706174" target="_blank">1</a>,用於如早期診斷、術後監控、用藥效力、追蹤預後等。<div> <br />日本國家癌症研究中心醫院 ( National Cancer Center Hospital East ) 應用了 Agilent SureSelect NCC oncopanel v.2 <span style="color: #ffa400;"><i>( 參考文章 <a href="https://welgene.blogspot.com/2021/04/sureselect-custom-assay-top-gear.html" target="_blank">SureSelect custom assay 癌症檢測開發 - 日本 TOP-GEAR 癌症基因檢測實例</a> )</i></span> 評估寡轉移性大腸直腸癌 ( oligometastatic colorectal cancer ) 的患者 cfDNA 突變存在率,並與預後狀況進行比對,該研究的內容與發現於下:<br /><br /><br /><b><i><span style="color: #6aa84f;">1. 樣品資訊</span></i></b></div><div><br /></div>此研究所分析的 20 位個案,為 2011 – 2017 間於日本國立癌症中心醫院接受過質子治療 ( proton beam therapy, PBT ) 或立體定位放射治療 ( stereotactic body radiotherapy, SBRT ) 的 CRC 患者 <span style="color: #ffa400;">( Tab 1 )</span>,這些個案於 PBT 及 SBRT 治療前以 EDTA 管收了 14 mL 周邊血液,後經 1,600 × g、4°C 離心 10 分鐘取得 plasma,交由日本國家癌症研究中心生物庫 ( National Cancer Center Biobank ) 以 -80 度凍存。申請後取得 4 mL plasma 進行 cfDNA 抽取,獲得的 cfDNA 以 Agilent SureSelect NCC oncopanel v.2 建立文庫 ( Library Preparation ) 並以 illumina 系統進行 40-45Gbase / cfDNA 的定序,後使用 Agilent SureCall 分析 114 個重要致病基因突變。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhc34jSNOUeT-wP0O-oMYEjL3xu50HwFzQ6MlVIqApz7aOrprXH-pPf7js6j9hWirfivc1Vm9_ri5hws_mrqQg93bNPBbGJhrGmLrR_I3LRiexm6u2_O9xo_68bcYZfE86Uw1Qzni5ugfRCy_UFnbkV2daNGTEM0jl3U_oEcjLTsm6aa60X2P5SOh9h/s800/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="663" data-original-width="800" height="530" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhc34jSNOUeT-wP0O-oMYEjL3xu50HwFzQ6MlVIqApz7aOrprXH-pPf7js6j9hWirfivc1Vm9_ri5hws_mrqQg93bNPBbGJhrGmLrR_I3LRiexm6u2_O9xo_68bcYZfE86Uw1Qzni5ugfRCy_UFnbkV2daNGTEM0jl3U_oEcjLTsm6aa60X2P5SOh9h/w640-h530/PIC_1.jpg" width="640" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><div style="text-align: center;">【Tab 1. Patient characteristics.】</div><div style="text-align: center;"><br /></div><span style="color: #999999;">The median age was 72 years (range=54-85 years). Twelve patients (60%) were male, and none had a performance status of ≥2. The metastatic lesions affected the lung (35%), liver (55%), and distant lymph nodes (10%). Thirteen patients (65%) had a single metastasis. Fifteen patients (75%) underwent PBT (relative biological effectiveness: 60-80 Gy/10-33 fractions) and 5 were (25%) treated with SBRT (35-48 Gy/4-5 fractions).</span></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><div><b><i><span style="color: #6aa84f;">2. 突變位點</span></i></b></div><div><br /></div>20 位個案的 cfDNA 定序結果顯示,有 10 個基因在族群中具有一定的族群突變率 TP53 ( 45% )、APC ( 40% )、KRAS ( 15% )、PIK3CA ( 15% )、NF1 ( 5% )、BRCA1 ( 5% )、ERBB2 ( 5% )、FBXW7 ( 5% )、KIT ( 10% )、與 HRAS ( 10% ) <span style="color: #ffa400;">( Fig 1 )</span>。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhF31NCnLCeuFKl-T7KAHJLK2T36ZiUvXYp4SnmDAcTUJ_NdHi-MnnkMbo8HZMG8IngTZV0lV_ScBW8sHydmUoqmddmo81ZPfap6J2hGm-6bOSkVf_PFwAZXU13WWnS3qCCS_q3ljUlcLB7Sp-mJl_F4K9WPBUdsrPu_IRl4r03oSaasBP2XvBYPgUB/s813/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="813" data-original-width="800" height="640" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhF31NCnLCeuFKl-T7KAHJLK2T36ZiUvXYp4SnmDAcTUJ_NdHi-MnnkMbo8HZMG8IngTZV0lV_ScBW8sHydmUoqmddmo81ZPfap6J2hGm-6bOSkVf_PFwAZXU13WWnS3qCCS_q3ljUlcLB7Sp-mJl_F4K9WPBUdsrPu_IRl4r03oSaasBP2XvBYPgUB/w630-h640/PIC_2.jpg" width="630" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption">【Fig 1. Mutated genes in 20 plasma samples from patients with oligometastatic colorectal cancer.】</td></tr></tbody></table><div><br /></div><div><br /></div><div><b><i><span style="color: #6aa84f;">3. 預後追蹤</span></i></b></div><div><br /></div>從 16 個能檢測到 cfDNA 突變的檢體中,具有 multi-clonal 突變者有較差的預後 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2a )</span>。另外對於具有肺轉移的 7 個檢體進行分析,發現未偵測到 cfDNA / 突變者皆有較長、較理想的存活狀況 <span style="color: #ffa400;">( Fig 2b )</span>。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjlbxZ6tbpjRgZCTPnNo5jg3U8e0AhS6X2mdlAXWosOkdtgd6HcdZNPKX3au6NiKj6sgtGensnYZANqhYWFC0aMyWIBj1ZpgRvvxJS1ThzuTvNVNO7LWdgh9o6vbGzG8BDSwCdQEihQvA5cWg6EVTBeB-AmbVwC64mAFc6gbIMOBNrZfnmQofYn07mx/s800/PIC_3.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="400" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjlbxZ6tbpjRgZCTPnNo5jg3U8e0AhS6X2mdlAXWosOkdtgd6HcdZNPKX3au6NiKj6sgtGensnYZANqhYWFC0aMyWIBj1ZpgRvvxJS1ThzuTvNVNO7LWdgh9o6vbGzG8BDSwCdQEihQvA5cWg6EVTBeB-AmbVwC64mAFc6gbIMOBNrZfnmQofYn07mx/s16000/PIC_3.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><div style="text-align: center;">【Fig 2. Progression-free survival curves.】</div><div style="text-align: center;"><br /></div><span style="color: #999999;">(a) Comparison of progression-free survival between patients with clonal versus multi-clonal oligometastatic colorectal cancer. (b) Comparison of progression-free survival depending on detectability of cfDNA among lung oligometastatic colorectal cancer.</span></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div>雖然先前已有 CRC 的 cfDNA 定序研究結果,但此研究為第一個 oligometastatic CRC 的 cfDNA 預後狀況分析。雖然沒有發現與存活率相關的特定突變位點,但透過 cfDNA 中的 multi-clonal mutation 存在性,還是能與預後有所關聯。另外也觀察到 cfDNA 的偵測率,與肺轉移的個案存活率相關。這個結果顯示液態活檢技術對於病程控管追蹤有正面助益,在技術更加成熟的未來,應能有效引導疾病治療對策,並及提昇病患生活品質。<div><br /></div><div><br /></div><br /><span style="color: #ffa400;"><b>【參考資料】</b></span><br />1. <a href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1706174">https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1706174</a><br />2. <a href="https://ar.iiarjournals.org/content/41/2/829">https://ar.iiarjournals.org/content/41/2/829</a>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-27201621698402669162022-05-13T00:00:00.000-07:002022-05-18T19:40:46.854-07:00東京大學醫院 DNA、RNA 癌症檢測 SureSelect Exome 開發<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEggqOyBjjnbsLe9hlxxyaDUiIRQUUx4IF-IlhbMgADyy_YiRu-PctPIau1QbUsDzWQADoWsqZcCWNUpjEAWQkyDig1QkBfj1XLI85qVHyXe9OkdR0Vn91JiSHCogGRYO-HYvQNP_FnhZcAvETL0mdWXa36oFpcxIMhA_5ZWK_iJFG7pE3ZYMGAZqaZ3/s395/Blog.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="288" data-original-width="395" height="233" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEggqOyBjjnbsLe9hlxxyaDUiIRQUUx4IF-IlhbMgADyy_YiRu-PctPIau1QbUsDzWQADoWsqZcCWNUpjEAWQkyDig1QkBfj1XLI85qVHyXe9OkdR0Vn91JiSHCogGRYO-HYvQNP_FnhZcAvETL0mdWXa36oFpcxIMhA_5ZWK_iJFG7pE3ZYMGAZqaZ3/s320/Blog.jpg" width="320" /></a></div><div style="text-align: center;"><br /></div>全外顯子 ( Whole Exome Sequencing, WES ) 定序技術推出後,許多突變在 ~18,000 蛋白質基因一次全掃描下都能被鑑定出來。WES 雖具有許多的效益,但對於臨床應用的樣品條件、整體成本、責任範圍挑戰,還需做最適化修改,挑選基因成為主題式檢測,將定序資源善用在極具臨床意義的 100 - 600 個基因 Panel 上。而 WES 通常用於無時間壓力的遺傳病因探詢,或作為 NGS Panel 開發時的 TMB、MSI 比對基準。<br /><br /> 2017 年,日本東京大學醫院使用 Agilent SureSelect 開發癌症檢測 Panel — Todai OncoPanel ( TOP ),TOP 系統為了因應 DNA 及 RNA 兩種不同檢測需求,所以將之設計成雙 panel 系統 ( twin-panel system ),這樣即能以分別最佳化的設計,分別掃描 DNA 與 RNA 的變異,其研究 / 開發資訊:<br /><br /><span style="color: #6aa84f;"><b><i>1. 雙檢測內容</i></b></span><div><br /></div><table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align: center;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhmsk99BzRDHbZ_YHUihXRF7lradfTbzKGWzTSZXGrx46LI7l3eaM35IYW4-qDnR1TahcLEv_8hLqpAl3TxLTvmRSynx14hTdgxoZObDggcJjmhT4X7iGIZv_1g3QMClvb7fROaq2wS2ThJMU58yR3CyvZ7gOzWFoP84iNrLta3AhPl5tkzMdN3csBM/s800/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="269" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhmsk99BzRDHbZ_YHUihXRF7lradfTbzKGWzTSZXGrx46LI7l3eaM35IYW4-qDnR1TahcLEv_8hLqpAl3TxLTvmRSynx14hTdgxoZObDggcJjmhT4X7iGIZv_1g3QMClvb7fROaq2wS2ThJMU58yR3CyvZ7gOzWFoP84iNrLta3AhPl5tkzMdN3csBM/s16000/PIC_1.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><br /><b>【 Fig1. TOP twin‐panel 】</b><br /><br /><div style="text-align: left;"><span style="color: #999999;">( 1 ) DNA Panel – 464 個基因的 SNV、indels、CNV,及其 TERT promoter 突變偵測。</span></div><div style="text-align: left;"><span style="color: #999999;">( 2 ) RNA Panel – gene fusion、exon skipping 偵測,與 ( 或 ) RNA expression 分析。</span></div></td></tr></tbody></table><br /><br /><b><span style="color: #45818e;">• gene fusion</span></b><br /><br />RNA 分析是更合適而有效率找到基因融合的方式,使用 junction capture 技術開發捕抓 RNA fusion <span style="color: #ffa400;">( Fig2 )</span>,split read 越多表示偵測到越多發生融合的位點 <span style="color: #ffa400;">( Fig3A )</span>,使用 SureSelect 系統針對重要目標基因客製設計、結合 junction capture 技術捕獲 RNA fusion,可大幅減少探針 <span style="color: #ffa400;">( Fig3B )</span>、捕抓範圍 <span style="color: #ffa400;">( Fig3C )</span> 的成本 ( 減少 ~ 14倍 ),是臨床在經濟與效能雙重考量下的理想選擇。<div><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjAm5wdf5Q0JWx98QwGllk37Wql1IiX_yvvHdyF4uRijgVk8kzkiSsMxiE8SCvWdnN_vUKYwS0_cLpRMTpbxkze1CT2nkJPyTu2TNbayXMRxLIzILOEx-tYYJgeEGzokZY01yrBU7IRaVXVLRLLQ2VR-NSEQA63UQyFeS95HqRF4Whi-cUjveYYdEXD/s400/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="157" data-original-width="400" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjAm5wdf5Q0JWx98QwGllk37Wql1IiX_yvvHdyF4uRijgVk8kzkiSsMxiE8SCvWdnN_vUKYwS0_cLpRMTpbxkze1CT2nkJPyTu2TNbayXMRxLIzILOEx-tYYJgeEGzokZY01yrBU7IRaVXVLRLLQ2VR-NSEQA63UQyFeS95HqRF4Whi-cUjveYYdEXD/s16000/PIC_2.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><b>【 Fig2. Exon junction capture method. 】</b><br /><br /><span style="color: #999999;">Capture probes were designed to target the cDNA sequences within 120 bases from the estimated fusion junctions to efficiently and specifically obtain split reads that support the fusion transcript.</span></td></tr></tbody></table><div><br /></div></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhY7UkHtP4NgPzdOwShozaXXSC68XVojZiyVFCc5LwM2_v2Y4gvOcxottdkE4NTjl_WX1_ZDck93vNCPY6um1I8pymZrXVPe1vnP7N825jaBDuGcMXF1OBs3jAy3JdrRKEFLgCq-cwJew22N8wy0Hp7JwAnzVRDCU1Z3jWiiBCzwoqRgV7TcR4sY5Uv/s800/PIC_3.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="553" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhY7UkHtP4NgPzdOwShozaXXSC68XVojZiyVFCc5LwM2_v2Y4gvOcxottdkE4NTjl_WX1_ZDck93vNCPY6um1I8pymZrXVPe1vnP7N825jaBDuGcMXF1OBs3jAy3JdrRKEFLgCq-cwJew22N8wy0Hp7JwAnzVRDCU1Z3jWiiBCzwoqRgV7TcR4sY5Uv/s16000/PIC_3.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><b>【 Fig3. Efficiency of the junction capture method. 】</b></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><b><span style="color: #45818e;">• exon skipping</span></b><br /><br />由於 MET 外顯子跳躍 ( MET exon 14 skipping ) 與多種癌症形成有關,該團隊進一步評估 junction capture RNA-seq 是否可有效偵測 exon skipping 變異所產生的異常 transcripts,對比正常樣本 <span style="color: #ffa400;">( Fig4A, Case #27 )</span>,RNA-seq 可確認 exon skipping 發生位置,TOP RNA panel 在 5 個 FFPE 樣本 <span style="color: #ffa400;">( Fig4B, Case#39~43 )</span> 成功識別 MET exon 14 skipping,而在其他 34 例無 MET 突變者 <span style="color: #ffa400;">( Fig4B, Case#1~34 )</span> 之中,未檢測到突變訊號。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgohOfBzNGqgHsePPZk8Xjgvkf2r5i38f7kBYGR7T7i7j0jz3ljBCzKGsflzH4FolR8z26wOsqHgz6ikqkQQ04ShXF6Orko5cI-F25ZVEN16uItR5vcKx2Y_RWAHKgNyfm0w_TjKrlnL5u8k0iYVWuppjCp0Ix5MI2F2-GLuDqRR0dAODcZg82pgIl6/s800/PIC_4.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="575" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgohOfBzNGqgHsePPZk8Xjgvkf2r5i38f7kBYGR7T7i7j0jz3ljBCzKGsflzH4FolR8z26wOsqHgz6ikqkQQ04ShXF6Orko5cI-F25ZVEN16uItR5vcKx2Y_RWAHKgNyfm0w_TjKrlnL5u8k0iYVWuppjCp0Ix5MI2F2-GLuDqRR0dAODcZg82pgIl6/s16000/PIC_4.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><b>【 Fig4. RNA-seq reads for a MET exon 14 skipping. 】</b><br /><span style="color: #999999;"><br />RNA-seq was performed using three different methods: poly(A) selection of RNA (NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit, NEB) and coding exon capture (TruSight RNA Pan-Cancer Panel, Illumina) or junction capture (Agilent SureSelect Custom) of cDNA.</span></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><span style="color: #45818e;"><b>• gene expression</b></span><br /><br />接著開發團隊選了 7 個做了 TOP RNA panel 的癌症案例,取其冷凍樣品進行了一般 polyA RNA-seq 實驗,兩者皆對目標基因群計算表現量 RPKM 數值。兩兩比對 TOP Panel 的 FFPE RNA 數值與 polyA RNA-seq 的冷凍樣品 RNA 數值 <span style="color: #ffa400;">( Figure 5 )</span>,兩著高度一致,顯示 TOP RNA Panel 可以良好呈現基因表現量資訊。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiFxYqGJR3QAGKNrbBOs1H8d8p5KwPTlvK5suclDJT7DsfnLdngWdgHL0qs99W41ydpR3p-1sfQcnwe6ol-uixXUOcxIXCYvuS4bCgtFt28EYt6y5DCeGEdIj1Nz89_VQqZNJl5eDIUJA2faJJMnr0Z8mbrse3jeDLRogp3P_8kWdOcwjZtZrQftBNM/s800/PIC_5.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="456" data-original-width="800" height="365" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiFxYqGJR3QAGKNrbBOs1H8d8p5KwPTlvK5suclDJT7DsfnLdngWdgHL0qs99W41ydpR3p-1sfQcnwe6ol-uixXUOcxIXCYvuS4bCgtFt28EYt6y5DCeGEdIj1Nz89_VQqZNJl5eDIUJA2faJJMnr0Z8mbrse3jeDLRogp3P_8kWdOcwjZtZrQftBNM/w640-h365/PIC_5.png" width="640" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><b>【 Figure 5. Validation of expression analysis using the TOP RNA panel. 】</b><br /><br /><span style="color: #999999;">Expression analysis was performed for 7 tumors to compare the performance of the TOP RNA panel using FFPE specimens with that of RNA-seq using frozen specimens and poly(A) mRNA enrichment.</span></td></tr></tbody></table><br /><br /><b><span style="color: #45818e;">• sequencing success rate</span></b><br /><br />最後審視樣品量與定序成功率的關係 <span style="color: #ffa400;">( Figure 6, 7 )</span>。DNA panel <span style="color: #ffa400;">( Figure 6 )</span> 的整體成功率為 84%,其中 DNA 樣品符合最適量 500ng 時成功率為 98%;1-50ng 樣品的成功率最差只有 50%,但如果有成功定序的還是可以獲得有用的資訊。RNA panel <span style="color: #ffa400;">( Figure 7 )</span> 整體成功率為 85.4%,符合最適量 500ng 時成功率為 88%;1-50ng 樣品的成功率為 36% ; 當加入 DV200 來偕同評估時,樣品 RNA > 200ng 且 DV200 > 40% 時具有 100% 成功率。<table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgS-yK--f07lA1sC7kuuwNfzmHed6eSpTw60Rcl89-fop_OKWxIIAgmBr7-fIV85sL8T6X4LJFCS5yI4xlQ2hGWr8lr-YjuoCq_cFOKRQckjnWKjhOe4SaaMbNQRNiQ0ZZtvZJj6YZetLKbSX4cprRdVmBSKJ6yZs_QQDxjPqBp6z8GpaT4kpgVMDiz/s400/PIC_6.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="215" data-original-width="400" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgS-yK--f07lA1sC7kuuwNfzmHed6eSpTw60Rcl89-fop_OKWxIIAgmBr7-fIV85sL8T6X4LJFCS5yI4xlQ2hGWr8lr-YjuoCq_cFOKRQckjnWKjhOe4SaaMbNQRNiQ0ZZtvZJj6YZetLKbSX4cprRdVmBSKJ6yZs_QQDxjPqBp6z8GpaT4kpgVMDiz/s16000/PIC_6.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><b>【 Figure 6. TOP DNA panel sequencing success as a function of specimen characteristics. 】</b></td></tr></tbody></table><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiwba0FuDBXUNoeFaCkIfAK9usyv4zsKhO4KESMO4i-U8O80Es9reTY_zLUJH5SJN0BplbdCeI03Eab78-Je1SGQ-wMDzC9BEHBCUq4mNKYv55MyeGyJ7top6KW6uxM7hWBXkZLfkjC--nCHE4zfc1jE9lWKi-kmyrE1IwZBQaHYgarYq_7OSNNtFxe/s800/PIC_7.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="253" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiwba0FuDBXUNoeFaCkIfAK9usyv4zsKhO4KESMO4i-U8O80Es9reTY_zLUJH5SJN0BplbdCeI03Eab78-Je1SGQ-wMDzC9BEHBCUq4mNKYv55MyeGyJ7top6KW6uxM7hWBXkZLfkjC--nCHE4zfc1jE9lWKi-kmyrE1IwZBQaHYgarYq_7OSNNtFxe/s16000/PIC_7.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><b>【 Figure 7. TOP RNA panel sequencing success as a function of specimen characteristics. 】</b></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><span></span><div><br /></div><div><i><b><span style="color: #6aa84f;">2. 臨床測試與研究</span></b></i><br /><br /></div><div>TOP 一共偵測了 315 個臨床樣本、10 種以上的癌別;根據不同程度 / 可行性的治療措施 <span style="color: #ffa400;">( Figure 8 )</span>,將每個樣本分配到合適的級別 <span style="color: #ffa400;">( Figure 9 )</span>,TOP 檢測為後續可採取的治療方針,提供了實質參考。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjKeu3RIpiFumPU4aQlGgEDaQ9azDqb-c9rInQp0TppuRgsjhnQ2Jpq5hLVyt-iikCPKug3wKMUsAyBQb35CDpTEdHTXnAeFkNfwDneAHR6edl4_ql-bxEK5LuMEcIKaQR0BDzHxM7mnP_gduSyCWFNnMCjBCbhZUdXufth3JNAiLkdPLwCx6P9SvFd/s800/PIC_8.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="675" data-original-width="800" height="540" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjKeu3RIpiFumPU4aQlGgEDaQ9azDqb-c9rInQp0TppuRgsjhnQ2Jpq5hLVyt-iikCPKug3wKMUsAyBQb35CDpTEdHTXnAeFkNfwDneAHR6edl4_ql-bxEK5LuMEcIKaQR0BDzHxM7mnP_gduSyCWFNnMCjBCbhZUdXufth3JNAiLkdPLwCx6P9SvFd/w640-h540/PIC_8.jpg" width="640" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><b>【 Figure 8. TOP evidence level classification. 】</b><br /><br /><span style="color: #999999;">The evidence level classification used to annotate gene alterations in TOP testing is indicated. PMDA: Pharmaceuticals and Medical Devices Agency; FDA: Food and Drug Administration.</span></td></tr></tbody></table><br /><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiVqxxXabomjIdKQ94OM3_v26vADN79uqB3ueGMw46OCAu_BIgrMdO_EPRXhKAe--7ldovkiG-X8aEHYs-29ULAPFGKg__95tY8aeJGBfST5Pi9mKqENgbCGYuL0d97jeoYlN7m8uVfjU62jdVej70WtNwugqodoASIkxPsfxBlHVaEhj-I03_XZeTs/s800/PIC_9.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="258" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiVqxxXabomjIdKQ94OM3_v26vADN79uqB3ueGMw46OCAu_BIgrMdO_EPRXhKAe--7ldovkiG-X8aEHYs-29ULAPFGKg__95tY8aeJGBfST5Pi9mKqENgbCGYuL0d97jeoYlN7m8uVfjU62jdVej70WtNwugqodoASIkxPsfxBlHVaEhj-I03_XZeTs/s16000/PIC_9.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><b>【 Fig9. Clinical actionability of somatic alterations revealed by the TOP. 】</b><br /><br /><span style="color: #999999;">The levels vary according to whether the mutations are a Pharmaceuticals and Medical Devices Agency‐recognized biomarker (Tier 1), a Japanese clinical trial‐targeted biomarker or a US Food and Drug Administration‐recognized biomarker (Tier 2), an investigational agent sensitizing gene alteration or an oncogenic alteration supported by a knowledge database (Tier 3), an oncogenic alteration supported by a research paper (Tier 4) or a recurrently reported alteration in a knowledge database.</span></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><div>Todai OncoPanel ( TOP ) 的開發,能夠對 FFPE 樣本中的癌症相關基因進行全面的分析,且能實用在癌症診斷、對應於臨床現行的治療方案,依循著臨床正規標準 ( CLIA-lab ) 建構一套完整的定序流程系統 <span style="color: #ffa400;">( Fig10 )</span>,提供可信的分析報告,加速精準醫療發展、實踐精準治療。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjquIwAYxXi8T44OdZuky1t8UMFT6MWVzQoVW0I1_mZDcPai-j46EnsCk6dqiuLfIxsEeq3bOOVRINk2z630MUmceYejoxaRQShZm8adEd5J9R1FMN-Xa_EfzX5Z2i7Na7mm9j9i3C7d42K0mDweahxJ5APMEgZ0G0DVLTonMAO0cJOCtP-cNptSyB9/s800/PIC_10.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="405" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjquIwAYxXi8T44OdZuky1t8UMFT6MWVzQoVW0I1_mZDcPai-j46EnsCk6dqiuLfIxsEeq3bOOVRINk2z630MUmceYejoxaRQShZm8adEd5J9R1FMN-Xa_EfzX5Z2i7Na7mm9j9i3C7d42K0mDweahxJ5APMEgZ0G0DVLTonMAO0cJOCtP-cNptSyB9/s16000/PIC_10.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><b>【 Fig10. TOP clinical sequence workflow. 】</b></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><div><br /></div><div><div><b><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span></b></div><div>1. <a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6447855/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6447855/</a></div></div><div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-53002229404192018692022-04-26T00:30:00.000-07:002022-04-26T20:16:00.839-07:00美國 FDA WES TMB 標準化 加速免疫治療應用與發展<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjMIq3ErnSt5HNavPSYiYRCSrUR-zwfXBzHMKvN_cP2I4c7k-nbxEtLcwVFEDFLyanvAeX6QzkFzLC_nLnf9DAF0zd7mopu_RHv_M0I3LvkINQmwDP0q9NbhqsnSQCgaQS_9rglLM51YPtgVvvMOsY5Y3cOlvxfqttJ5KRKzzuGUlGykGUPfMqBaGTp/s800/blog.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="629" data-original-width="800" height="252" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjMIq3ErnSt5HNavPSYiYRCSrUR-zwfXBzHMKvN_cP2I4c7k-nbxEtLcwVFEDFLyanvAeX6QzkFzLC_nLnf9DAF0zd7mopu_RHv_M0I3LvkINQmwDP0q9NbhqsnSQCgaQS_9rglLM51YPtgVvvMOsY5Y3cOlvxfqttJ5KRKzzuGUlGykGUPfMqBaGTp/s320/blog.jpg" width="320" /></a></div><div><br /></div>腫瘤突變負荷 ( tumor mutational burden, TMB ) 是腫瘤組織 DNA 中發現的突變總數,不出現在健康細胞中,因此有助於預測多種癌症類型對免疫、細胞專一治療的反應,腫瘤中更多的突變 ( TMB 值越大 ),意味免疫系統可能識別到這些突變的機會更高,而產生較好的免疫效果。 <br /><br /><div>全外顯子定序 ( WES ) 是目前臨床研究測量 TMB 的方法,面對不同癌症 panel,其內容、基因覆蓋率都是影響 TMB 值標準不一致的因素之一。為使 TMB 成為臨床環境有效、一致的參考依據,2021年,美國 FDA - Friends of Cancer Research TMB Harmonization Project 使用 SureSelect V6+COSMIC 為基準,進行相關評估:<br /><br /></div><div><br /></div><div><b><i><span style="color: #6aa84f;">一、測試方法</span></i></b><br /><br /></div><div>11個不同單位的 Cancer Panel <span style="color: #ffa400;">( Table1 )</span> 的 TMB 檢測數值,與 SureSelect V6+COSMIC 標準 TMB 數值進行比對 <span style="color: #ffa400;">( Figure1,<a href="https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=1002272" target="_blank">Agilent SureSelect V6+COSMIC</a> )</span>,藉此評估各家 Panel 涵蓋是否足夠計算 TMB 數值,以及不同演算法的一致度,逐步讓各家 Cancer Panel 的 TMB 數值成為統一語言。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhR3oiiRQH6xAa5OqKP0DnG__70mNFobfxRFv87ybUqFEbvEAGLDkROOpDEnn0ZmBy7PpU2MvVDaho5PVq3xyvv69rqEJyV9CAb21JBMdmfmtoBRSb6yY5jyDDuwYpgwM77hKBjxyRUs4w8hS-3a7aNu_tiHtJFF-7xUzNleE-XK77671Rrak9uJH_r/s800/PIC_1.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="493" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhR3oiiRQH6xAa5OqKP0DnG__70mNFobfxRFv87ybUqFEbvEAGLDkROOpDEnn0ZmBy7PpU2MvVDaho5PVq3xyvv69rqEJyV9CAb21JBMdmfmtoBRSb6yY5jyDDuwYpgwM77hKBjxyRUs4w8hS-3a7aNu_tiHtJFF-7xUzNleE-XK77671Rrak9uJH_r/s16000/PIC_1.png" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><span style="color: #444444;"><br />Table1. Description of the 11 participating diagnostic NGS panels</span></td></tr></tbody></table><br /><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhH9LK9I-S-OLU5OaBLBklVfITnCG3RMVupsjLk9LY7fjlKyyowCrduVRX4E-Cg3pexRRDCdYxRn898LC15J1iPpn-QfDh9wDIzHk9j5IL0YmNUwKGFWJ0mwljxClrB-YMeG6ZBPtd0FAxybgu3gqaS_dhvTN027Ec1ixcBQKIf3fTTcVd2JpGd26HM/s800/PIC_2.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="716" data-original-width="800" height="573" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhH9LK9I-S-OLU5OaBLBklVfITnCG3RMVupsjLk9LY7fjlKyyowCrduVRX4E-Cg3pexRRDCdYxRn898LC15J1iPpn-QfDh9wDIzHk9j5IL0YmNUwKGFWJ0mwljxClrB-YMeG6ZBPtd0FAxybgu3gqaS_dhvTN027Ec1ixcBQKIf3fTTcVd2JpGd26HM/w640-h573/PIC_2.png" width="640" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><span style="color: #666666;"><br /><div style="text-align: left;">Figure1. Ninety-five percent prediction intervals for panel tumor mutational burden (TMB) estimated at discreet whole exome sequencing (WES) TMB values (5, 10, 15 and 20 mut/Mb), by laboratory across all laboratories. Blue arrows represent the estimated mean panel TMB for each laboratory. Red dashed line represents the discreet WES TMB value at which prediction interval is calculated.</div></span></td></tr></tbody></table><br /><br /><div><b><i><span style="color: #6aa84f;">二、實證成果</span></i></b><br /><br /><b>1. 統一 TMB 應為每一兆鹼基中含有的突變數目 ( mut/Mb ) 報告之。</b><span style="color: #666666;"><br /></span></div><div><span style="color: #666666;">不同 WES 系統的基因組大小可能不同,將 WES 的 TMB 值定為體細胞突變數量,而 panel 的 TMB 值定為每 Mb 基因組區域的體細胞突變密度 ( mut/Mb ),排除來自每個 panel 偵測基因範圍大小不同的變因。</span><br /><br /><b>2. 計算 TMB 驗證研究應標準化,包括對分析準確性 ( accuracy )、精密度 ( precision ) 和靈敏度 ( sensitivity ) 的評估。</b><br /></div><div><span style="color: #666666;">由於每個 panel 檢測的基因內容、分析技術的敏感性、分析規格都有所不同也難以被調整、標準化,因此參考 FDA 建議驗證準則 </span><span style="color: #ffa400;">( Table2 )</span><span style="color: #666666;">,直接對 TMB 數值偵測進行嚴格處理計算,確保其可靠性。</span><br /><br /><b>3. 各 TMB 應與 WES 為參考比對,確保 panel 檢測的一致性。</b><br /></div><div><span style="color: #666666;">WES TMB 比對是目前公認確認 TMB 準確性的方法,建議其 TMB 落在 0-40 mut/Mb 範圍中,即為一個可校準 panel TMB 值的參考標準。</span></div><div><span style="color: #666666;"><br /></span></div><div><div class="separator" style="clear: both;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiMxtOQ6iwvwqVowE6wiZkIWoEaAQlsD2rcYbIc6j26gi9mEp66hxWk8knszUB3rgsGMLcz1MacLecpBeufdSNOnKVydWe-8sYq3RiNbGgxuXYN6Msnk23tPVKQ5VFU49q-ePWBQI73hSyIypSR8IjJLMQHtmRV8HgkQR2IUWMareh0gxfIpA1h1dTt/s1066/PIC_3.png" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="1066" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiMxtOQ6iwvwqVowE6wiZkIWoEaAQlsD2rcYbIc6j26gi9mEp66hxWk8knszUB3rgsGMLcz1MacLecpBeufdSNOnKVydWe-8sYq3RiNbGgxuXYN6Msnk23tPVKQ5VFU49q-ePWBQI73hSyIypSR8IjJLMQHtmRV8HgkQR2IUWMareh0gxfIpA1h1dTt/s16000/PIC_3.png" /></a><br /><br /><br /></div><div class="separator" style="clear: both;">NGS 基因檢測的臨床應用越來越多,需採用一個約定的標準,方便醫療行為、臨床研究上的互相溝通,讓檢測結果具有更明確而直接的參考含意,FDA 使用 SureSelect WES 定義 TMB 的基準,穩定、完整的結果,支持 SureSelect WES 是一個合適臨床進行標準化驗證的系統 / 平台。<br /><br /><br /><br /><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span><br />1. <a href="https://precision.fda.gov/challenges/17">https://precision.fda.gov/challenges/17</a><br />2. <a href="https://precision.fda.gov/challenges/18">https://precision.fda.gov/challenges/18</a><br />3. <a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32217756/">https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32217756/</a><br />4. <a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34606929/">https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34606929/</a></div></div><div></div><div></div><div></div><div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-31718413366432419112022-04-08T01:54:00.000-07:002022-04-08T01:54:53.454-07:00地區特色 WES 資料庫範例 --- Hong Kong ( HKG ) 全外顯子公開資料庫歐美在過去十年有序組織、統整基因資料庫,估計 2022 年 3 月為止全世界已累積了 >75 萬筆的全外顯子 ( Whole Exome Sequencing, WES ) 數據,這些 WES 數據展現了豐富的人群健康與基因關聯成果 ( <a href="https://welgene.blogspot.com/2022/03/20.html">20 萬筆 WES 資料開啟新世代心臟代謝疾病基因研究</a>、<a href="https://welgene.blogspot.com/2022/03/35-brca1brca2atmtet2.html">35 萬筆 WES 資料發現蛋白質截短型突變對壽命及疾病影響</a> )。也由於 WES 的研究、應用效力極佳,越來越多的大型研究計劃列為必收數據外,WES 也成為臨床檢查工具 ( <a href="https://welgene.blogspot.com/2021/08/wes-population.html">WES 第一線診斷使用,揭開 population 外顯子序幕</a> )。 <br /><br /> 然而,這些歐美資料庫中的亞洲數據,主要是亞洲溫帶區域的族群,缺乏南方漢人族群 ( Southern Chinese Subgroup ) 的遺傳資訊。2021 年時香港用了 205 組 SureSelect V6 WES 資料,公開了第一個南方漢族區域型的基因資料庫,補上了過往大型資料庫的空白,並獲得新的變異發現:<br /><br /><br /><b><i>1. <span style="color: #6aa84f;">~20% 獨有的變異</span></i></b><br /><br />與千人基因組計劃 ( 1000 Genomes Project, 1KGP ) 中,來自中國不同族群 <span style="color: #ffa400;">( 圖一 CHS;CDX;CHB )</span> 的基因組序列資料比對,香港 <span style="color: #ffa400;">( 圖一 HKG )</span>、與中原漢人分區的變異總數為 128,470 種,其中 25,472 種為香港特殊而其他區域沒有的突變點,將近於 20%。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh_XVCu19mwdgXLYrVRRBhClnOFFH7rzsu4g6RJ7GIgtoFzj1II0gdRhTxA1GQf7M8LAu_vb9yUMjCJ6yg0bzP3fobe5MoPVHZvjcOU6-W4cV8ff3Ib7RFQjs2aB6vYPJiYeBFenbB9NNZs0VhrWocKvSWE-4YJxwfJG79m440hsxSPMDEkkI-LGf7b/s800/PIC_1.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="616" data-original-width="800" height="308" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh_XVCu19mwdgXLYrVRRBhClnOFFH7rzsu4g6RJ7GIgtoFzj1II0gdRhTxA1GQf7M8LAu_vb9yUMjCJ6yg0bzP3fobe5MoPVHZvjcOU6-W4cV8ff3Ib7RFQjs2aB6vYPJiYeBFenbB9NNZs0VhrWocKvSWE-4YJxwfJG79m440hsxSPMDEkkI-LGf7b/w400-h308/PIC_1.png" width="400" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><div style="text-align: center;">【圖一】Population comparison of HKG variants</div><div style="text-align: center;"><br /></div><div style="text-align: left;"><span style="color: #cccccc;">3 public Chinese populations of 1KGP project: CHS, CHB and CDX (CHB: Han Chinese in Beijing, China; CHS: southern Han Chinese; CDX: Chinese Dai in Xishuangbanna, China)</span></div></td></tr></tbody></table><div><br /></div><br /><b><i>2. <span style="color: #6aa84f;">增加重要亞洲區域族群變異資料</span></i></b><br /><br />為檢測該數據在於亞洲特定族群的意義,將其納入 1KGP 後,皆顯示 HKG 基因資料具有極顯著 <span style="color: #ffa400;">( 圖二A** )</span> 的重要性。 <br /><br /> 為確認該數據可信度,與其他來源香港資料 <span style="color: #ffa400;">( 圖二B:, NARD_HK、圖二C, Yu et.al )</span> 整合比較,分別互相呈現高度相關,暗示 HKG 可作為香港族群的代表資料庫之一。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi3pTVU3em6jzJDVbZP9hSfJnfXWXogksMYBzJMo63dxukgYm6lfR9o4-FzwugNIzNyurf65ojvTVz0ejYd94R8wO-O760kVK8uk0NjFnKhyuR7ekjSGllNycfhoBpXG34Isai-9QZip0hGm4vyordGR_2o1U9cAWrluhhzDqQPT8wT--hBIQokkpJR/s800/PIC_2.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="233" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi3pTVU3em6jzJDVbZP9hSfJnfXWXogksMYBzJMo63dxukgYm6lfR9o4-FzwugNIzNyurf65ojvTVz0ejYd94R8wO-O760kVK8uk0NjFnKhyuR7ekjSGllNycfhoBpXG34Isai-9QZip0hGm4vyordGR_2o1U9cAWrluhhzDqQPT8wT--hBIQokkpJR/s16000/PIC_2.png" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption"><div style="text-align: center;">【圖二】Validation of HKG variants by imputation and correlation analysis</div><br /><span style="color: #cccccc;">(A) Imputation testing using the two reference panels: 1KGP and 1KGP + HKG. The average Info scores ± standard deviation error was based on 22 chromosomes. ** indicates the difference meets a significant level with p<0.01 of student's T test. (B) Correlation analysis using AFs of variants in HKG and NARD_HK (Northeast Asian Reference Database). (C) Correlation analysis using AFs of variants in HKG and Yu et al. 2021 reported actionable pharmacogenetic variants.</span></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div><b><i>3. <span style="color: #6aa84f;">新的可能致病變異</span></i></b><br /><br />利用 CADD ( Combined Annotation-Dependent Depletion ) 評估突變的有害程度,數值越高,危險度越高,可作為該變異是否可能影響疾病的初步判斷依據。<div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgq8t7m0P9bgt9OV_3qnqEr7fpc9ruyaU67BTpsOzo_KpBx38uwphNl2kfWTu0fTKhs2xePS2IbT6srszHDn0ny77sk4gXDg88Dl2l_2z3eooPxpkLnsH2f9KflllgDS_hfoypnCe7mkza1gTuXGlz-XdfPeE8Kp6UnEAYaAzwzb1GhsXlZlM4U7g19/s800/PIC_3.png" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="351" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgq8t7m0P9bgt9OV_3qnqEr7fpc9ruyaU67BTpsOzo_KpBx38uwphNl2kfWTu0fTKhs2xePS2IbT6srszHDn0ny77sk4gXDg88Dl2l_2z3eooPxpkLnsH2f9KflllgDS_hfoypnCe7mkza1gTuXGlz-XdfPeE8Kp6UnEAYaAzwzb1GhsXlZlM4U7g19/s16000/PIC_3.png" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖三】Pathogenicity score in novel and all variants of HKG</td></tr></tbody></table><br /><br />HKG 僅有 205 組數據,雖不及國際基因研究的規模,仍是亞洲或其他發展中國家可效仿、著手建立自有的基因體資料庫,也成功填補該族群 / 區域的數據空白,只要逐漸收集樣本、累積數據,將有助於發現、分析出基因突變在於特定人群的生理意義或致病性,促進基因遺傳學從區域、到全球的醫學發展。<div><br /></div><div><br /></div><div><br /></div><div><div><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span></div><div>1. <a href="https://academic.oup.com/nargab/article/4/1/lqac005/6524304">https://academic.oup.com/nargab/article/4/1/lqac005/6524304</a></div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-62300900674288292692022-04-01T00:00:00.000-07:002022-04-01T00:04:15.454-07:0035萬筆全外顯子資料發現 BRCA1、BRCA2、ATM、TET2 蛋白質截短型突變對壽命及疾病影響<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiGSu7NdiNt58vGV-fNgvUsKpTSQchW_nyqxjq4DaNIWWfmC3TyI9gRyVkNlgRyrWZZGtxH9TqHuAFRv1VBZBSIo1fN2j_5E79Kfm3fkb33w6AJorqLGZYhl-Bo-to5Yj0LCya7t10w8kzoqb8h2iq5aC659C93mjI5nhsFqJcUSpMUb0P7yqH7KaYf/s800/blog.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="533" data-original-width="800" height="213" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiGSu7NdiNt58vGV-fNgvUsKpTSQchW_nyqxjq4DaNIWWfmC3TyI9gRyVkNlgRyrWZZGtxH9TqHuAFRv1VBZBSIo1fN2j_5E79Kfm3fkb33w6AJorqLGZYhl-Bo-to5Yj0LCya7t10w8kzoqb8h2iq5aC659C93mjI5nhsFqJcUSpMUb0P7yqH7KaYf/s320/blog.jpg" width="320" /></a></div><div><br /></div>回溯十年前,外顯子定序 ( whole exome sequencing, WES ) 剛起步,當時多用於尋找單一樣本上的單點變異,時至今日,因其成本下降、通量提升、技術穩定,成為大型生醫研究、臨床檢測的利器,由於過往基因資料的積累仍不完整,藉由大規模進行 WES 的方式,是目前全世界取得基因研究成果並應用於癌症醫學的主流方式,可挖掘細微變異及更深層的基因訊息,促進精準醫療發展、加速實用於人類疾病的診療之中。<div><br /></div><div>蛋白質截短型突變 ( protein-truncating variant,PTV ) 嚴重影響蛋白合成及基因表現完整性,是潛在影響人類健康的一種突變類型,美國 Biogen 公司自 UK biobank 中取得 352,338 筆歐洲血緣 WES 資料,深入研究 PTV 與人類壽命的關聯性並發現:</div><div><br /></div><div><br /><i><b>1. <span style="color: #6aa84f;">四個顯著影響人類存活長短的基因 — BRCA1、BRCA2、ATM、TET2</span></b></i></div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgW8-wtHA7GuXLpOUCODtYyvTEHyEgFwi82XJZ3LEN7FK9jSN0d-0pEUp_EVixkada3goHbLyk7oLJ1gpTx8FP8v2uKOqNkeJ61N0VChpk8Uw69VtefM6yTPh6Qb5opt7D3XK6Qs8YyL0if8XfUaIectDptLSUnqTymlSMtmrcLVrF6lnPjwSjdrgUV/s800/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="713" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgW8-wtHA7GuXLpOUCODtYyvTEHyEgFwi82XJZ3LEN7FK9jSN0d-0pEUp_EVixkada3goHbLyk7oLJ1gpTx8FP8v2uKOqNkeJ61N0VChpk8Uw69VtefM6yTPh6Qb5opt7D3XK6Qs8YyL0if8XfUaIectDptLSUnqTymlSMtmrcLVrF6lnPjwSjdrgUV/s16000/PIC_1.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><span style="color: #999999;">Fig. 1: Manhattan plots of gene-based PTV-burden survival analyses in the discovery cohort of 238,239 UK Biobank participants for six survival phenotypes analyzed.</span></td></tr></tbody></table><br />與 ClinVar 資料庫結果一致,BRCA1、BRCA2 曾被報導是遺傳性乳腺癌及卵巢癌相關的致病基因,在 WES 結果 <span style="color: #ffa400;">( Fig. 1 )</span> 也顯示其為高度影響女性 ( Female probands' lifespan ) 與母親 ( Mothers' lifespan ) 存活狀況;並找出其他關鍵 PTV 基因 — ATM、TET2 變異訊息。<div><br /></div><div><br /></div><div><b><i>2. <span style="color: #6aa84f;">BRCA2、BRCA1、TET2、ATM 與 phenotype 關係 — phenome-wide association studies ( PheWASs )</span></i></b></div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEg-vxt_TJC_Oas-x_4XbEpYcwqHdndS1xif2XezrZBDaKHyRVMUF3zeZiTLRiJ3-uQWOnET1uXsPdgqSku8VVR0o6iQgL9LOztvZqpmghNi-e2_X0j9TAL1EU-42VYwp2793o0S1SXhwC9jEDgb0UtYBQOzDkrhw3GSzpwBoIzW9lo8eFJHrILST3lO/s800/PIC_2.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="536" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEg-vxt_TJC_Oas-x_4XbEpYcwqHdndS1xif2XezrZBDaKHyRVMUF3zeZiTLRiJ3-uQWOnET1uXsPdgqSku8VVR0o6iQgL9LOztvZqpmghNi-e2_X0j9TAL1EU-42VYwp2793o0S1SXhwC9jEDgb0UtYBQOzDkrhw3GSzpwBoIzW9lo8eFJHrILST3lO/s16000/PIC_2.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><span style="color: #999999;">Fig. 2: Phenome-wide association plots for BRCA2, BRCA1, TET2 and ATM in all probands.</span></td></tr></tbody></table><br /><div><br /></div>為了深入了解壽命如何受到疾病影響,以及與基因訊息之間的關聯,自 WES 結果的四個關鍵 PTV 基因連接予疾病 / phenotype 的研究,PheWAS 分析指出 BRCA2、BRCA1、ATM 與女性乳腺癌和卵巢癌相關;且 BRCA2 亦與男性前列腺癌相關,與已知的基因角色一致。PheWAS 分析揭示了 TET2 PTV 與白血球 ( eosinophil、neutrophil ) 數量異常有關,存在造血不良 ( myelodysplastic syndrome )、血球缺乏症 ( agranulocytosis、thrombocytopenia )、急性骨髓性白血病 ( acute myeloid leukemia ) 的風險。<div><br />WES 已成為常規、快速、經濟的全篩選技術,各種人群與疾病 WES 數據都能輕易的累積,使得人類蛋白質編碼變異的研究再也不被實驗所束縛,進入了大數據分析能力決定成果的階段。如以 35 萬筆 WES 數據為例,所要處理的 SNV / SNP 共有 ~ 17.5 billion ( 175億 ) 個,隨著 WES 資料量日益增加,這個數據量也會隨之上升。今日的基因醫學、分子生物研究已進入了數據處理世代,若要找出影響健康相關的變異,就要從處理基因數據訊息開始,這轉換猶如 1995 年的網路世界是 " 建立網頁 " 為主,但 2005 年後是 " 資料搜索 ( Google ) " 為主,但轉換也讓網路成日常實用工具。在基礎研究與精準醫學 WES 應用進入爆發期之刻,您的參與非常值得。<br /><br /><br /><br /><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span></div>1. <a href="https://www.nature.com/articles/s43587-022-00182-3">https://www.nature.com/articles/s43587-022-00182-3</a>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-53434616232490635622022-03-25T02:00:00.066-07:002022-03-25T02:05:54.238-07:0020萬筆全外顯子資料 開啟新世代心臟代謝疾病基因研究<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjHCcMkfhXO7kBS6-WcaIgUL-q0jv9dGFfPLSVZzo3N3FFOo37d7QwFT8hxe9kbUaBG7mB3SuVLF_El8yqCWvPTbMSz2r5p2l6trkClCLqx6erj9wt5IISQVU4N0jQ15A9S-UlPNYd_3mV2z8NeCnunPwFWFj0oSDCzHVUdPsZw090UwjrvgvgusFTy/s800/Blog.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="533" data-original-width="800" height="213" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjHCcMkfhXO7kBS6-WcaIgUL-q0jv9dGFfPLSVZzo3N3FFOo37d7QwFT8hxe9kbUaBG7mB3SuVLF_El8yqCWvPTbMSz2r5p2l6trkClCLqx6erj9wt5IISQVU4N0jQ15A9S-UlPNYd_3mV2z8NeCnunPwFWFj0oSDCzHVUdPsZw090UwjrvgvgusFTy/w320-h213/Blog.jpg" width="320" /></a></div><div><br /></div>第一套人類全外顯子 SureSelect kit ( WES, Whole Exome Sequencing ) 自 2009 年問世,至今十年左右的時間,WES 已被應用在各個重要的生醫健康主題。它能高效率專注於分析功能蛋白編碼區域 ( CDS ) 的突變,至今因定序成本經濟、自動化快速穩定,成為大規模人群基因研究、檢測的重要工具,越來越多數十萬至百萬個體的龐大基因數據計畫都在進行中 ( 更多大規模 WES 計畫介紹,請看:<a href="https://welgene.blogspot.com/2021/08/wes-population.html">https://welgene.blogspot.com/2021/08/wes-population.html</a> ),有助發現更多潛藏的基因訊息,促進醫學於疾病與基因檢測、治療策略的未來實用性。<div><br />基因生醫研究的領先學術機構 — 麻省理工 - 哈佛博德研究所 ( Broad Institute ) 於 2022 年 2 月 Nature Genetics 期刊,發表由17萬5千筆 WES 中找到的心臟 / 代謝疾病相關罕見基因變異。研究人員自 50 萬人 UK Biobank 基因資料庫中,擷取出 200,337 筆全外顯子定序資料進行分析並獲得以下發現:</div><div><br /><div><h4 style="text-align: left;"><i>1.<span style="color: #6aa84f;"> 57 種疾病相關遺傳變異</span></i></h4></div><div>包括 MYBPC3、LDLR、GCK、PKD1、TTN 等…已知的遺傳致病基因;並發現微小罕見突變 — GIGYF1,為潛在影響第二型糖尿病的變異基因 ( OR for diabetes >1,正相關 ),且與其他資料庫結果一致。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjv3yRPRbx_Rr42RlYwtzogCqoNgO-MPn_KC_Lip_wMR_UxoGRNHfvt0iao9KmG3m1QBah-kTYWi_FpNweRmxcgBc6ghXsdad9vAdqi-8g-2uVMeCvUc5UquQWea_g3iNYHvlUqOM21Z1727efKir4rNx3029LDXSMZDax-DwR3Y_FnbbkdeasYZpg8=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="147" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjv3yRPRbx_Rr42RlYwtzogCqoNgO-MPn_KC_Lip_wMR_UxoGRNHfvt0iao9KmG3m1QBah-kTYWi_FpNweRmxcgBc6ghXsdad9vAdqi-8g-2uVMeCvUc5UquQWea_g3iNYHvlUqOM21Z1727efKir4rNx3029LDXSMZDax-DwR3Y_FnbbkdeasYZpg8=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><span style="text-align: start;">【圖一】Meta-analysis results for GIGYF1 rare variants and type 2 diabetes across three cohorts.</span></td></tr></tbody></table><div><br /></div><h4 style="text-align: left;"><i><b>2.<span style="color: #6aa84f;"> 1.0 – 2.4% 的受測者攜帶罕見致病變異</span></b></i></h4><div>GCK、HNF1A 基因變異與糖尿病密切相關;PDX1 可能多為 missense 型變異 ( p.Cys18Arg ),找出更深層、微小的罕見突變訊息。</div><div><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEi5QsukAMujzS6DqKUklfeJeH99cJ3XLXIL_rOeFwOq5M90Ku9n-F5NoUnViOgSIYdv3Rc1orDmuvAywnopu7FiQarfUHSgB5rrV010B3riqPViI4Sxs6dgN2V4pvsseK8Ugwfk0WIRMN3uinpuL2FOL89TOWiTdaHGW4J_sy-KGsF9N9AwwOXDKUwx=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="476" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEi5QsukAMujzS6DqKUklfeJeH99cJ3XLXIL_rOeFwOq5M90Ku9n-F5NoUnViOgSIYdv3Rc1orDmuvAywnopu7FiQarfUHSgB5rrV010B3riqPViI4Sxs6dgN2V4pvsseK8Ugwfk0WIRMN3uinpuL2FOL89TOWiTdaHGW4J_sy-KGsF9N9AwwOXDKUwx=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><span style="text-align: start;">【圖二】Carrier frequencies of putatively pathogenic variants in monogenic diabetes genes.</span></td></tr></tbody></table><div><br /></div><div><span style="color: #999999;">The top of the graph is a bar chart showing carrier frequencies for loss-of-function (LOF) variants and pathogenic/likely pathogenic (P/LP) variants for genes in which variants are known to cause dominant type 2 diabetes or maturity-onset diabetes of the young (MODY). The bottom of the graph is a pruned heatmap showing associations between such variants with diabetes and chronic kidney disease, where blue indicates lower risk of disease and red indicates increased risk of the disease.</span></div><div><br /></div><div><br />複雜疾病一向都難以進行基因機制剖析,但由 UK Biobank 提供之數十萬筆 WES 資料,Board Institute 得以找到大規模 Exome 數據中蘊含的細微基因訊息,即使 WES 技術已可成熟應用於精準醫療,挖掘研究關鍵、罕見的變異如何影響疾病更加重要,才可在實際臨床檢測的數據中,對應取得有意義的病因來源,並為未來的先進醫療奠定基礎,提升人群健康。 <br /><br /></div><div><br /></div><div><br /></div><div><span style="color: #ffa400;">【參考資料】 </span><br />1. <a href="https://www.nature.com/articles/s41588-021-01011-w#Abs1">https://www.nature.com/articles/s41588-021-01011-w#Abs1</a></div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-27439032326048810612022-03-18T00:30:00.001-07:002022-03-20T17:49:57.876-07:00安捷倫 2022 春季發表會 — Genomic Applications and Solutions ( 二 ) 自動化 Exome 平台與全新基因晶片設計<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjZea8S0-vCdG9gU3K5AAg0Ab-b_osluXf7FftrvwytHtEEp8uvJNFS-wummIgD6RFhFqd8iQxjVynPo0pznJvdxqGnEJeJ9IkWep1FW3_LjTh9ykU1TwYJFwVmz13IOETMzpFy_IlKMv_kcEoI-OxxbKhLZMcRwd5PDgMDWVM2VORKrwp_HN2hFv5K=s800" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="533" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjZea8S0-vCdG9gU3K5AAg0Ab-b_osluXf7FftrvwytHtEEp8uvJNFS-wummIgD6RFhFqd8iQxjVynPo0pznJvdxqGnEJeJ9IkWep1FW3_LjTh9ykU1TwYJFwVmz13IOETMzpFy_IlKMv_kcEoI-OxxbKhLZMcRwd5PDgMDWVM2VORKrwp_HN2hFv5K=s16000" /></a></div><br /><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgsA636SBDGwCOwS8QjQhjlYMb6WudzsXQUk7z5AmEUfZByW5Wzd8M51jaV_kNjgdEKFg6XNxS4G1PhyecTWl87mMg2kZ9IiJJQZm801YasrEdO-eoQ2enUGLfhmOUCoGR0Ks6GR93wqFEm1M59iVxnPj7qYO7CMlW-NfBOjaFGngE_4wcoDvzn6NOa=s800" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="533" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgsA636SBDGwCOwS8QjQhjlYMb6WudzsXQUk7z5AmEUfZByW5Wzd8M51jaV_kNjgdEKFg6XNxS4G1PhyecTWl87mMg2kZ9IiJJQZm801YasrEdO-eoQ2enUGLfhmOUCoGR0Ks6GR93wqFEm1M59iVxnPj7qYO7CMlW-NfBOjaFGngE_4wcoDvzn6NOa=s16000" /></a></div><br />安捷倫帶來 2022 年最新、全面的基因解決方案,不僅僅在 NGS 方面 ( Exome 全自動平台 ),也同步推出全新遺傳應用的客製基因晶片產品 ( Microarray ),為所有遺傳、癌症、其他疾病應用,提供最合適且有效的分析工具。<div><br /></div><h3 style="text-align: left;"><span style="color: #0097e0;">Exome 全自動平台</span></h3><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgpnSCwJnNjm9z9hA5zH_G1Gt7hAvSEsJOwXj9glAIgFb11Fvhevl0qB9-Blty5EoKoOyxmzlzlzrJCj3Jss44m9zpiuGyCWDHx42CvTwULpGXmKh0t4UzgJSoPUbiXzi1Mw5e7iqAZpKv9QIEMwp1cEWxDZmRa4sauRdAkDuM4Np8UBeJOs0k72jEJ=s800" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="705" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgpnSCwJnNjm9z9hA5zH_G1Gt7hAvSEsJOwXj9glAIgFb11Fvhevl0qB9-Blty5EoKoOyxmzlzlzrJCj3Jss44m9zpiuGyCWDHx42CvTwULpGXmKh0t4UzgJSoPUbiXzi1Mw5e7iqAZpKv9QIEMwp1cEWxDZmRa4sauRdAkDuM4Np8UBeJOs0k72jEJ=s16000" /></a></div><br /><div>NGS 用於日常檢查的第一個門檻,即是如何處理大量樣品以及維持穩定與可靠度,因此全自動化的 NGS 平台已是 2022 年後的精準醫療主流方案,身為 Exome 技術開拓者,除了帶來最新第八代 SureSelect 外顯子技術外 ( 了解 SureSelect Exome 技術,請看:<a href="https://welgene.blogspot.com/2022/03/2022-genomic-applications-and-solutions.html">( 一 ) 2022 精準醫學 Exome 平台</a> ),安捷倫為 SureSelect 開發一套全自動 Exome 解決平台,包含:</div><div><br /></div><div><br /></div><b><i><span style="color: #ffa400;">1. 精準醫學核酸品管系統 ( Quality Control ) — TapeStation System</span></i></b><div><br /></div>簡易、快速、經濟、不汙染等操作特性為臨床場域所需,TapeStation 為安捷倫為精準醫學量身打造的 QC 系統,除了具有上述特性外,它能處理各類型 FFPE、liquid biopsy 之樣品分析,這些特性使得 TapeStation 為日本病理學會所推薦,成為日本癌症檢測 FFPE DNA / RNA 品質控管系統。Tapestation 量測的 DIN 值在日本病理學會的測試下,可用來評估 NGS 實驗成功率,因此 Tapestation 能在第一時間藉由 DNA / RNA QC,帶給您國家級醫學指引的實驗成功率預估。<div><div><ul style="text-align: left;"><li><b>各類樣品適用:</b>FFPE DNA / RNA、cell free DNA 品質數據化與評估 </li><li><b>臨床支持:</b>日本病理學會、LDTS 遺傳檢測建議</li></ul><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEi9IwRzor-Mh2jQuVz7lm_NFqStGHcB-7RsjK-YFvBcJQOoDap2qe4ZBc5oUKwOxRCMhJWnrRLhjfMaVyILTOFxVC7LM_utATquYmd9Ijdn15pw8GvQP8nd4FQ30LgK4b_GvXfB_7zyP3TsDPcCYZ1gFGYyHv3LrAQwxoLayssUKiv3oc_R3IZrCiV-=s884" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="884" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEi9IwRzor-Mh2jQuVz7lm_NFqStGHcB-7RsjK-YFvBcJQOoDap2qe4ZBc5oUKwOxRCMhJWnrRLhjfMaVyILTOFxVC7LM_utATquYmd9Ijdn15pw8GvQP8nd4FQ30LgK4b_GvXfB_7zyP3TsDPcCYZ1gFGYyHv3LrAQwxoLayssUKiv3oc_R3IZrCiV-=s16000" /></a></div><div><br /></div><div><br /></div><b><i><span style="color: #ffa400;">2. 全自動建庫 — Magnis</span></i></b><br /><div><br /></div></div></div>自動化處理取代了繁複人工製備,使得高可靠、大量的 Exome 檢測成為可能。Magnis 系統為 NGS Exome library 製備提供了一個全自動完整方案,只要 ~5分鐘的時間擺放樣品與試劑,即可輕鬆的為您完成 Exome library 製備。自動化流程、穩定的 library 產出,讓每一個實驗室都能輕鬆的進行 Exome 實驗。<br /><ul style="text-align: left;"><li><b>全自動處理:</b>穩定、不汙染,提高實驗效能,減少人為失誤</li><li><b>臨床應用:</b>SureSelect 外顯子或客製方案,彈性配合遺傳、癌症檢測內容需要</li></ul><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjlUDaREpiT2ekGtt1WqGZ4d2h4z0yCW9L3hQrUEUsZcsECoh6id2vF9GVkDXehcN9yaYv97JpwwIXkz4Q-DqId67ReW2DnzhUS-PDzJwMqHafCJL4TaCGpFbRAD5Wzy8G-lSgRHERrB8otJCOB9VlNYjQip7JX-kiV4IfKNpINM7zi9jPxvSIPXobg=s890" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="890" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjlUDaREpiT2ekGtt1WqGZ4d2h4z0yCW9L3hQrUEUsZcsECoh6id2vF9GVkDXehcN9yaYv97JpwwIXkz4Q-DqId67ReW2DnzhUS-PDzJwMqHafCJL4TaCGpFbRAD5Wzy8G-lSgRHERrB8otJCOB9VlNYjQip7JX-kiV4IfKNpINM7zi9jPxvSIPXobg=s16000" /></a></div><div><br /></div><br /><span style="color: #ffa400;"><b><i>3. 數據分析 — Alissa Clinical Informatics</i></b></span><div><br /></div>安捷倫 Alissa Interpret 瞄準全院需求而開發的雲端臨床報告系統,該系統獲得 USA Class I Exempt Medical Device, Europe CE IVD, Canada, Australia Class I IVD Device 等醫療認證,提供準確全面的 NGS 數據分析,輸出醫療判讀結果。讓精準醫學實用化的最後關鍵,獲得值得信賴的分析搭配。<div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgbKd38O9nQoq_FIAscu0hgdv2EXkjP1_BERHlD0pXQEBbHXw0AFaKZFsY7iyZ5yB66atg15rLJtocl6i__Qb1h6bx62H48WAa0hujTzhUCA_NStT9be1YB-msxeJh0QAMgiVsWqkBFwdha5B8Xglx1eY4M6iiTEIUpU4MZmk83zb0SqhTaDpgU4BmY=s800" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="124" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgbKd38O9nQoq_FIAscu0hgdv2EXkjP1_BERHlD0pXQEBbHXw0AFaKZFsY7iyZ5yB66atg15rLJtocl6i__Qb1h6bx62H48WAa0hujTzhUCA_NStT9be1YB-msxeJh0QAMgiVsWqkBFwdha5B8Xglx1eY4M6iiTEIUpU4MZmk83zb0SqhTaDpgU4BmY=s16000" /></a></div><br /><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEisVl0ZcbMuZav-1PFWXb22CRnCt2dvMJtzkAlHckxhDdqCaWSSHGitDhzNag-xMmJKJtzG_ZHKlPF3LQSqwtDkeSVRxgJFvCzrIAesOT72Yhgzwc2ml3r5pDNxtQU3rsHj4kC15zDvijsbE76aYX7lH1t_auOIEQrzJXspMQ5l9Q8QSSigdCQqa7vO=s800" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="525" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEisVl0ZcbMuZav-1PFWXb22CRnCt2dvMJtzkAlHckxhDdqCaWSSHGitDhzNag-xMmJKJtzG_ZHKlPF3LQSqwtDkeSVRxgJFvCzrIAesOT72Yhgzwc2ml3r5pDNxtQU3rsHj4kC15zDvijsbE76aYX7lH1t_auOIEQrzJXspMQ5l9Q8QSSigdCQqa7vO=s16000" /></a></div><br /><div><br /></div><b>【 SureSelect 全自動 WES 平台臨床實用成果 】</b><br /><br />本次邀請到<b>台灣遺傳基因診斷先驅 --- 柯滄銘婦產科 & 基因飛躍生命科學實驗室 ( GENE PHILE ) <u>黃建豪</u>研究員</b>,分享胎兒基因次世代定序流程中使用 Magnis 全自動 SureSelect 平台經驗。他表示 Magnis 全自動外顯子流程,使實驗室運作效益提升到三倍,同時也強化了實驗穩定度。Magnis 能讓醫檢師 / 高階人力從繁複長時間的人工操作中釋出,進而專注於後續驗證、突變臨床資訊比對,使得檢測結果更具臨床效益。<div><br /></div><h3 style="text-align: left;"><span style="color: #0097e0;">基因晶片 SurePrint Community Design Prenatal CGH+SNP 遺傳應用</span></h3>香港中文大學產前遺傳診斷中心 Richard Choy 教授與安捷倫合作,融合安捷倫獨家基因晶片技術與香港臨床研究案件,開發出雙效產前晶片並成功於全球遺傳市場應用。此次發表會榮幸邀請到教授本人分享應用成果,顯示晶片優於 Low Pass WGS 的臨床實際數據,並肯定晶片搭配遺傳 Exome 測試的趨勢。<div><br /></div><div>晶片設計特色:</div><ul style="text-align: left;"><li>CGH+SNP 60K 設計,維持 ISCAv2 同級 CNV 解析下,同時偵測 UPD</li><li>加強 * 152 個先天性異常、智力障礙、發育遲緩遺傳 CNV 區域</li></ul><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEg_xQCvTgYUpraVR1at5FsOFTL86W1P1iU9C6NPLFOqDzGYfGVQCiKyW7szgW59T5Dqjy9HcrR9A1KtQrZTqL6QjAXfliar_iuv4KHuxsqJYZqWO6j0-2AonV9Ouw9TQdBjqPpvJhJcjzULZs2TEkvlRVtDEnDpGKLDiGljrSrEa1j5lbVgFQk-XXaA=s800" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="243" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEg_xQCvTgYUpraVR1at5FsOFTL86W1P1iU9C6NPLFOqDzGYfGVQCiKyW7szgW59T5Dqjy9HcrR9A1KtQrZTqL6QjAXfliar_iuv4KHuxsqJYZqWO6j0-2AonV9Ouw9TQdBjqPpvJhJcjzULZs2TEkvlRVtDEnDpGKLDiGljrSrEa1j5lbVgFQk-XXaA=s16000" /></a></div><br /><div><br /></div>此次 " 安捷倫 2022 春季發表會 ",除了展示最前沿的自動化基因方案革新,以及國際醫學使用範例外,也藉由 Magnis 台灣應用實例,顯示 SureSelect 自動平台確實能協助台灣發展精準檢測平台。生物技術的進步十分快速,不斷加強微弱訊號的捕抓,以及對複雜、跨層面的生物分子訊號進行全面解析,而解析出的疾病變異,則在不遠的將來利用合成生物學來加以修補,安捷倫將不斷精進,為您帶來更多的基因高端科技,將之擴展到更大規模疾病檢測。幫助醫學研究實用化,更為未來的先進治療,築下根基。<div><br /></div><div><br /></div><div><br /></div><div><div style="text-align: right;"><b>關於發表會其他介紹,歡迎到部落格觀看:</b></div><div style="text-align: right;"><a href="https://welgene.blogspot.com/2022/03/2022-genomic-applications-and-solutions.html"><i>(一) 2022精準醫學 Exome平台</i></a></div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-37286654569488756962022-03-11T00:30:00.002-08:002022-03-20T19:27:48.998-07:00安捷倫 2022 春季發表會 — Genomic Applications and Solutions ( 一 ) 2022 精準醫學 Exome 平台<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEg329iD1xUIfnnzY3mfAmRkk5FypGgx51iRKsSLjfQ1SAt211AjrQlawMnKuT3g36K5RAooZXBjzhE6EJd49NHhr5wgRjAQf97Lh9pWVafeBS-jfpO_kkoebtTswNbLf_lW5_b-2roeVmt4r5KdpsdEP3xJox2OfNGU_xrgKk_f3rMUcf3XKNwl6zcn=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="533" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEg329iD1xUIfnnzY3mfAmRkk5FypGgx51iRKsSLjfQ1SAt211AjrQlawMnKuT3g36K5RAooZXBjzhE6EJd49NHhr5wgRjAQf97Lh9pWVafeBS-jfpO_kkoebtTswNbLf_lW5_b-2roeVmt4r5KdpsdEP3xJox2OfNGU_xrgKk_f3rMUcf3XKNwl6zcn=s16000" /></a></div><br /><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhe1n0W7MIaiBxXw1uqQfui1cq9nlDNzMQZVY7xx3z0BZy6ake4tSek1BtLtCAkunO6dNlTG-XmrlfRYlZPoxehl_2IX7Eyyg0Ek7oxW9def7Zt4bVqZyA8iBR5UISzNrQkBjROGlS9LW0CHBozbUkbz2-hIOjuoJcOKNsA31aQi_a_sGRcdkEInK0Q=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="533" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhe1n0W7MIaiBxXw1uqQfui1cq9nlDNzMQZVY7xx3z0BZy6ake4tSek1BtLtCAkunO6dNlTG-XmrlfRYlZPoxehl_2IX7Eyyg0Ek7oxW9def7Zt4bVqZyA8iBR5UISzNrQkBjROGlS9LW0CHBozbUkbz2-hIOjuoJcOKNsA31aQi_a_sGRcdkEInK0Q=s16000" /></a></div><br /><div>過去 5 年基因技術的快速演進,已將 NGS 從人工研究模式,蛻變為自動化精準醫療應用,在遺傳、癌症、罕病檢查中發揮良好效益,安捷倫科技 ( Agilent Technologies ) 不斷的發展技術新領域,2022 年舉辦春季發表會,介紹安捷倫基因平台 2022 年的最新方案、 各國 LDT 及 IVD 使用範例、與台灣應用成果。</div><div><br /></div><div><br /></div><h3 style="text-align: left;"><b><span style="color: #0097e0;">2022 自動化精準醫學 Exome 平台</span></b></h3><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjCapkzAyrFizij_P6YvqCVtbtIhjoD99OoHvvEHBZsKuUaPoFHvPW3vd4dVgE-OadFK1JE5pgZkNDgqzDOzmgS5HETxWPHNc8bqd6hzzGwWdkJqrXb-z-tGTKfoWlKjM9n9Q0oBPI_xR46LiyjiMMh4wc-6PXPFr0OwCBFbsnicz_jjymtsSJ9vwyx=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="489" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjCapkzAyrFizij_P6YvqCVtbtIhjoD99OoHvvEHBZsKuUaPoFHvPW3vd4dVgE-OadFK1JE5pgZkNDgqzDOzmgS5HETxWPHNc8bqd6hzzGwWdkJqrXb-z-tGTKfoWlKjM9n9Q0oBPI_xR46LiyjiMMh4wc-6PXPFr0OwCBFbsnicz_jjymtsSJ9vwyx=s16000" /></a></div><br /><div>安捷倫為 Exome 技術開創者,自 2009 年來,以 SureSelect 為中心,一路擴充到 Exome 的自動化、結合數據處理與分析,最終推出第一套從樣品到結果的自動化 Exome 整合方案 ( end to end solution ),首先介紹這套方案的主角 — SureSelect Exome 的革新:</div><div><br /></div><div><br /></div><h3 style="text-align: left;"><b><span style="color: #0097e0;">新一代高效率基因抓取 — SureSelect V8 技術</span></b></h3><div><div>SureSelect 為全外顯子定序的創始技術,今年安捷倫發表了第八代技術 - SureSelect V8 產品家族,針對 " 癌症 "、" 遺傳 "、" 轉譯研究 " 進行設計,提供最全面的內容。另外,這代技術也導入了 DNA、RNA 共用處理流程,讓 FFPE RNA expression / fusion 偵測也能在新設計與自動化下進行。</div></div><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEghwqiQCXDrQAXSxcfjHe5RIvcjtj6RT2oGI992vxbjWKfDchNen0Dvxsudmm0JWsXUbZ3-LR0Knp4hyv45vYpuQp8hDUUNDjHFc_0iDvoZrFNq_drOdapG7xCQdLQhrA3BVBnn-PqO1UBdhUfedMrKPmGDW5dNbDIQ-G8VjceeYqJ2_bSnzTFsawsM=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="689" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEghwqiQCXDrQAXSxcfjHe5RIvcjtj6RT2oGI992vxbjWKfDchNen0Dvxsudmm0JWsXUbZ3-LR0Knp4hyv45vYpuQp8hDUUNDjHFc_0iDvoZrFNq_drOdapG7xCQdLQhrA3BVBnn-PqO1UBdhUfedMrKPmGDW5dNbDIQ-G8VjceeYqJ2_bSnzTFsawsM=s16000" /></a></div><div><br /></div><div><ul style="text-align: left;"><li><span style="background-color: #fff2cc;">全新設計 – 更簡單的探針設計、更有效的全外顯子抓取</span></li><li><span style="background-color: #fff2cc;">彈性應用 – 癌症、遺傳、轉譯醫學,三大主題搭配設計及客製方案</span></li><li><span style="background-color: #fff2cc;">臨床拓展 – FFPE 樣品、cell free DNA / RNA 實用技術持續發展</span></li></ul></div><div><br /></div><div><span style="color: #ffa400;"><b><i>a. SureSelect V8 基本版 WES – 癌症主題最適化</i></b></span></div><div><br /></div><div><div>基於 Refseq 更新蛋白質 CDS 編碼區範圍,並納入它牌忽略之困難抓取 CDS exons 及 TERT Promoter,精巧涵蓋了 35.1Mb 的抓取目標,以最低定序數據量,獲得高效、完整的全外顯子。適合需要超高定序深度的 FFPE、cell free DNA / RNA 樣品。</div></div><div><br /></div><div><br /></div><div><div><b><i><span style="color: #ffa400;">b. SureSelect V8+NCV 臨床加強版 – Clinvar、HGMD 遺傳非編碼變異最大收錄</span></i></b></div></div><div><br /></div><div><div>近年來遺傳突變的發現不斷擴展,許多造成基因 splicing 異常的 Non-Coding Variant ( NCV ) 非編碼區突變被找出,並收錄於 Clinvar、HGMD 臨床致病突變資料庫,這些 Pathogenic ( P ) & Likely Pathogenic ( LP ) NCV 為市面一般 WES / Exome 所無法偵測。SureSelect V8+NCV 針對 Clinvar 與 HGMD 的致病突變加強設計,並收錄 ACMG 73/74 genes 全部已知變異,能在一次的 Exome 測試中掃描已知的 CDS、NCV 遺傳致病突變。</div></div><div><br /></div><div><br /></div><div><b><i><span style="color: #ffa400;">c. SureSelect V8+UTR 轉譯研究版 – 市面最新 UTR 加強設計</span></i></b></div><div><br /></div><div>以往研究多聚焦於 CDS 編碼區,但近年 UTR 突變的研究也日益增加,像是免疫抑制基因 PD-L1 的 3'-UTR 突變會使得表現量異常上升,顯示 UTR 區域研究的重要性。安捷倫自 GENCODE v33 資料庫設計了 ~62,500 UTR 目標區段,使研究者得以涵蓋真正的 CDS+UTR 全外顯子,找出轉譯醫學新突破。</div><div><br /></div><div><span style="color: #999999;">***Kataoka K, Shiraishi Y, Takeda Y, Sakata S, Matsumoto M, Nagano S, et al. Aberrant PD-L1 expression through 3'-UTR disruption in multiple cancers. Nature. (2016) 534:402–6. doi: 10.1038/nature18294</span></div><div><br /></div><div><br /></div><div><b><i><span style="color: #ffa400;">d. SureSelect Custom Design – 打造您的特色應用</span></i></b></div><div><br /></div><div>SureSelect 能按照您的需求,設計出聚焦於癌症、遺傳基因,外加您專屬巧思的客製內容,基於安捷倫自動化平台,您的專屬設計能輕易的應用於日常檢查中,而日本國立癌症研究所、韓國首爾大學附屬醫院、Guardant Health、燃石醫學 BurningRock 等國家 / 國際單位,皆利用 SureSelect 打造 US-FDA IVD、LDT 精準醫學檢測,獲得穩定、高彈性擴充的臨床方案。</div><div><br /></div><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEilx6Kmv5vWCL3zySFR5J2q8-hWNXYDV84K8J5cbo2v2ZophEnJXgjNJhj1KpQQU4v4Ezlqhc_zPpjZekH6G0jDicNnscKOrbmyk-2zbRPKKn2GWDjN0_1DXsKdqL-rN9HHzGPEzjV6wDcVhxgYVCR4WyGC7d1EHInRs8wP0stPAsH3Qz8UKVzd6zbi=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="467" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEilx6Kmv5vWCL3zySFR5J2q8-hWNXYDV84K8J5cbo2v2ZophEnJXgjNJhj1KpQQU4v4Ezlqhc_zPpjZekH6G0jDicNnscKOrbmyk-2zbRPKKn2GWDjN0_1DXsKdqL-rN9HHzGPEzjV6wDcVhxgYVCR4WyGC7d1EHInRs8wP0stPAsH3Qz8UKVzd6zbi=s16000" /></a></div><br /><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjlVwctBBLo4GSXOfyM1PsGx5cbg-Ug6MR9N52t_o740Xl5KvwABqqAg8i23UXjmnHt5VUB1qeRtLcWfy4e2bNJQkMfE3JIgIx6I2VmP4GxUg_Uenx4ztZXiDP8VDEFQon-ykWqTL1zjIBAE6yWeb25CtSj4RgUHkb7V_--FwjjpDs0Mer1z3sGfyon=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="404" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjlVwctBBLo4GSXOfyM1PsGx5cbg-Ug6MR9N52t_o740Xl5KvwABqqAg8i23UXjmnHt5VUB1qeRtLcWfy4e2bNJQkMfE3JIgIx6I2VmP4GxUg_Uenx4ztZXiDP8VDEFQon-ykWqTL1zjIBAE6yWeb25CtSj4RgUHkb7V_--FwjjpDs0Mer1z3sGfyon=s16000" /></a></div><br /><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEiiIVThGLsC30KYK004psO3cl7wLlUsBay3-3nUfkOMCcvrp9HcNFoITTWrSibW_D1647nVmVAggPF6j5L2lVKawL9eJotZPl7tFE2TrkMDvIdcM4m8VKyWMvDGPDh03I-bX88jyt8lUvf0rxiyc2m7cAfTHiJzn_ejNrsTdd5VgZL01FrJqn6htSQa=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="390" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEiiIVThGLsC30KYK004psO3cl7wLlUsBay3-3nUfkOMCcvrp9HcNFoITTWrSibW_D1647nVmVAggPF6j5L2lVKawL9eJotZPl7tFE2TrkMDvIdcM4m8VKyWMvDGPDh03I-bX88jyt8lUvf0rxiyc2m7cAfTHiJzn_ejNrsTdd5VgZL01FrJqn6htSQa=s16000" /></a></div><div><br /></div><div><br /></div><div><br /></div><div><div style="text-align: right;"><b>了解更多發表會內容,下週接續介紹:</b></div><div style="text-align: right;"><span style="color: #38761d;"><a href="https://welgene.blogspot.com/2022/03/2022-genomic-applications-and-solutions_18.html"><i>( 二 ) 自動化 Exome 平台與全新基因晶片設計</i></a></span></div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-23173335378801204792022-01-24T17:30:00.002-08:002022-01-28T00:57:30.094-08:00RNA fusion 實驗演進 ( 下 ) - 舊把戲新玩法 RNA-capture NGS 與臨床實例<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEh20ML5LJs-f_XEGF_9YjdifXf8MGu-Dox4un2p9gmjjaJjFPI3ZUGAfF3TEgnm1JqiF3Otb9ShK4MbOT-BqfaqnXp4Y6kvkAsfia4JoE_ycjOsKfp_udGw1jP0UT0jpoo9K2ijfr6iE4RdGQggOcmsNhQATV2kcgfMNFiYnX9BYODSBsZFvUGjoNSx=s800" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="759" data-original-width="800" height="190" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEh20ML5LJs-f_XEGF_9YjdifXf8MGu-Dox4un2p9gmjjaJjFPI3ZUGAfF3TEgnm1JqiF3Otb9ShK4MbOT-BqfaqnXp4Y6kvkAsfia4JoE_ycjOsKfp_udGw1jP0UT0jpoo9K2ijfr6iE4RdGQggOcmsNhQATV2kcgfMNFiYnX9BYODSBsZFvUGjoNSx=w200-h190" width="200" /></a></div><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;">NGS 進行 RNA 分析起初以基因表現 ( gene expression ) 為主,隨著近來定序通量快速增加後,大型癌症基因體計畫也將 fusion RNA 找尋列入定序項目 ( 詳細介紹:<a href="https://welgene.blogspot.com/2021/11/rna-fusion.html">https://welgene.blogspot.com/2021/11/rna-fusion.html</a> )。相對於大型基因體計畫,主題式癌症研究或精準醫學則聚焦於 kinase RNA fusion 分析,利用 targeted RNA Sequencing 加強 kinome 基因的定序深度。相比之下,targeted sequencing ( Capture Seq, 99224 ) 增加約為傳統 RNA 定序 ( RNA-Seq, 340 ) 的 290 倍 <a href="https://www.nature.com/articles/nbt.2024"><i>1</i></a> <span style="color: #ffa400;">( 圖一 )</span>,關注特定 transcript 增加靈敏度及降低成本,有助發現更深入而完整的 RNA fusion 訊息 <span style="color: #ffa400;">( 圖二 )</span>。</div><div style="text-align: left;"><br />根據目前的技術,fusion RNA 定序透過 amplicon-based PCR 法、anchored multiplex PCR ( AMP )、hybrid capture 法來製備樣品,雖然 PCR 法允許 RNA 樣品需求量較低,但 PCR 偏好現象會影響 RNA library 製備的完整性。AMP 使用界於 exon-intron 的 primer,策略性地擴增 exon 或 intron 中可能發生 fusion 的基因區域,但還需考慮 PCR-bias 問題。而 RNA capture 可避開 PCR-bias,較均勻的捕抓目標片段,較能完整保留、不遺漏重要的基因訊息,是現今解析細微 RNA fusion 合適的工具 <a href="https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14737159.2021.1920399"><i>2</i></a> <span style="color: #ffa400;">( 圖三 )</span>。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhF4fveqdKazSzqwT26_CkViFFQx5BfSnU3pSOK9Q6f7TAi-NNf5I5UXFSNPCAr85YjCOUUgrQAzFu2m5dEdkbEUGpt8phuJrTjwp8bNdak1OOqXQ2OOSIBVtEL2E_aNVEGyt0oLcjoMfTGdaf8cMKEInT5E58kQI1kPtD8xQ7nbyCpMI0BHIpDyBDV=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="403" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhF4fveqdKazSzqwT26_CkViFFQx5BfSnU3pSOK9Q6f7TAi-NNf5I5UXFSNPCAr85YjCOUUgrQAzFu2m5dEdkbEUGpt8phuJrTjwp8bNdak1OOqXQ2OOSIBVtEL2E_aNVEGyt0oLcjoMfTGdaf8cMKEInT5E58kQI1kPtD8xQ7nbyCpMI0BHIpDyBDV=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖一】Novel RNA fusion detection by targeted RNA-Seq ( <span style="color: #990000;">Capture Seq</span> ).</td></tr></tbody></table><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhJG03l7jbWaZLKUNPwR0jA37kvcf0l-_bW4XiyCgO-ICtEa8dYxv1_-A7MFr9maygZI2ZHaP2jQKx8D4T-K2jB9wPTo3WMgcQ7m72R3uEtWDnovzigdbABMSPRhRQZtVrVattXZM595ER-A__okYQrVZjHZoFMD-dKE5a87_AB6mWNUBbTUT7__IAG=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="258" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhJG03l7jbWaZLKUNPwR0jA37kvcf0l-_bW4XiyCgO-ICtEa8dYxv1_-A7MFr9maygZI2ZHaP2jQKx8D4T-K2jB9wPTo3WMgcQ7m72R3uEtWDnovzigdbABMSPRhRQZtVrVattXZM595ER-A__okYQrVZjHZoFMD-dKE5a87_AB6mWNUBbTUT7__IAG=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖二】Targeted RNA-Seq offers highly robust fusion detection compared to whole transcriptome and mRNA-Seq methods.</td><td class="tr-caption"><br /></td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhJ-VAQkfkLGPhHzurn_H6dh4lf8NQO9JRLPyO-1KWnxFg2izLT39k-MfM4aa-7G0XZF2Oi3Z6eBEPpL1yDy0YKqIDZPZHLCGXq0TyK3tHlcTHw_VIfxrVeSuH7Xy9_AD4R9gsu6IaarbX3K-RkxjxgTTub30Mr0YXp1I0uRMiBl5en6dNspugh04qW=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="379" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhJ-VAQkfkLGPhHzurn_H6dh4lf8NQO9JRLPyO-1KWnxFg2izLT39k-MfM4aa-7G0XZF2Oi3Z6eBEPpL1yDy0YKqIDZPZHLCGXq0TyK3tHlcTHw_VIfxrVeSuH7Xy9_AD4R9gsu6IaarbX3K-RkxjxgTTub30Mr0YXp1I0uRMiBl5en6dNspugh04qW=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖三】Three NGS targeted approaches available for RNA fusion analysis.</td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;">Capture based target enrichment 配合定序技術在 RNA fusion 研究漸漸穩定成熟,近來蓬勃發展至疾病分子診斷的使用上。韓國於 2017 年開始研擬健保系統的癌症基因檢測,以首爾大學附設醫院為例,陸續開發了數種 solid tumor Oncopanel 設計。其中 fusion RNA 檢測也在開發之列,開發時測試了三種不同的 fusion gene 抓取法,以測試臨床適用性 <a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7460167/"><i>3</i></a> :</div><div style="text-align: left;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhYuL-ypTP0v0d3PWFmciXtm3Yoe97iqCAAc0HC2wj40RjN9uts1BLfESMWePlbJjt8nHdThnJC-94AE04q8hPYAEuwuJ24EqoGcZJLU_sSULdwD29GSxU7LtdZ6U2itUw0Wnh2SJy0dWe7TaxPqgmwzGnElkfm2YcQhlm2bN8TkiaJLT7eoP452wUP=s799" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="279" data-original-width="799" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhYuL-ypTP0v0d3PWFmciXtm3Yoe97iqCAAc0HC2wj40RjN9uts1BLfESMWePlbJjt8nHdThnJC-94AE04q8hPYAEuwuJ24EqoGcZJLU_sSULdwD29GSxU7LtdZ6U2itUw0Wnh2SJy0dWe7TaxPqgmwzGnElkfm2YcQhlm2bN8TkiaJLT7eoP452wUP=s16000" /></a></div><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;">為了臨床檢測使用的正確率,使用 AMP 所需的 RNA 樣品品質要求至少 DV200 ≧ 50% <span style="color: #ffa400;">( 圖四 )</span>,大幅增加臨床取樣、準備的困難度;Hybrid-capture 使用 DV200 ≧ 30% <span style="color: #ffa400;">( 圖四 )</span> 的 RNA,可在高靈敏度下,準確檢出 fusion gene,不遺漏任何基因訊息 <span style="color: #ffa400;">( 圖五 )</span>。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjbaS3JwFzzduhf4YVGZiAuFqg89GOER_9AYA7M9WdfTFm5fkrikkC5T-bhrNlzIvblFa7yILTfvD492doxlgUF8tXhbXbZs6FB-gFCG3MqsRO6x6AmpkQFhBItbYSqiLrX89WHvOz8XMWUdBSimSUmLdJMwZfQzti8ng_f7mX_VkpRB8KePpTuxxat=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="624" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjbaS3JwFzzduhf4YVGZiAuFqg89GOER_9AYA7M9WdfTFm5fkrikkC5T-bhrNlzIvblFa7yILTfvD492doxlgUF8tXhbXbZs6FB-gFCG3MqsRO6x6AmpkQFhBItbYSqiLrX89WHvOz8XMWUdBSimSUmLdJMwZfQzti8ng_f7mX_VkpRB8KePpTuxxat=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖四】RNA requirement for Anchored multiplex PCR based ( AMP ) and Hybrid-capture based ( SureSelect ) RNA-Seq.</td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjcl00VSTYhcibt_Vqt9IIJKYxtc8F_1p6j9C5Af_ca34EnjVk2dq-BKvqGUTift-oEH6UVPWE9TxrayQzc_BtSyzNTDTWyRW14BNyUAzbd1jaG3iINkCTn1slrX6Cf6jN5hwlmA9Y6xkGyzLRKchFF7eOpRP3VBt9ZdT16Dzti2QvDsT3EA8LGshcl=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="458" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjcl00VSTYhcibt_Vqt9IIJKYxtc8F_1p6j9C5Af_ca34EnjVk2dq-BKvqGUTift-oEH6UVPWE9TxrayQzc_BtSyzNTDTWyRW14BNyUAzbd1jaG3iINkCTn1slrX6Cf6jN5hwlmA9Y6xkGyzLRKchFF7eOpRP3VBt9ZdT16Dzti2QvDsT3EA8LGshcl=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖五】Anchored multiplex PCR based ( AMP ) and Hybrid-capture based ( SureSelect ) RNA-Seq detection.</td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;">Targeted RNA-Seq 作為臨床設計疾病特定 fusion 基因檢測,在分子診斷中越顯重要,需要一個靈敏度高、臨床樣品適用、準確性的實驗方法,Agilent SureSelect 系統基於 capture 技術,並具備樣品需求最佳化與高度自動化特性,是一套整合臨床需求的 RNA 檢測平台 <span style="color: #ffa400;">( 圖六 )</span>,為基因醫學帶來更多的研究價值,以期未來可以真正實用於精準醫療之中。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgxcqIZzFzMIYqM8RPXLBK6v59Mkm9Z4u5MtjvdKOY7QzH6t6svnCFNQiPdRjU8N-T6jS6O2IbF1FPd-8kW2Y3HwIymz3B0ycJPjvC7j8IrvT3WOWW3Jb-RDbRj7_lI_uO7x0TGBxBirpJfgMJ1Rqirsv9h9rKboVS7Qm_YDeHThAj95dKQ3JNZn_x2=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="152" data-original-width="800" height="122" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgxcqIZzFzMIYqM8RPXLBK6v59Mkm9Z4u5MtjvdKOY7QzH6t6svnCFNQiPdRjU8N-T6jS6O2IbF1FPd-8kW2Y3HwIymz3B0ycJPjvC7j8IrvT3WOWW3Jb-RDbRj7_lI_uO7x0TGBxBirpJfgMJ1Rqirsv9h9rKboVS7Qm_YDeHThAj95dKQ3JNZn_x2=w640-h122" width="640" /></a></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhknZp1QoYqtN8DnY0tmmWhlodb9YUOYfXtrWcaq4FZ6j3bXlO1qbVjwcnktcqz_LQb-LtsfB3PU1VndMqCKbkExcDiZUyx6X26rHfUp4-I3H70y-h8AQQ4uhhqZCPDkr7FMjjFN_cfS2Z8tf3hF4jSgqFncBl74LOexKZZLhJicuHb_MJBou2WWcsq=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="482" data-original-width="800" height="386" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhknZp1QoYqtN8DnY0tmmWhlodb9YUOYfXtrWcaq4FZ6j3bXlO1qbVjwcnktcqz_LQb-LtsfB3PU1VndMqCKbkExcDiZUyx6X26rHfUp4-I3H70y-h8AQQ4uhhqZCPDkr7FMjjFN_cfS2Z8tf3hF4jSgqFncBl74LOexKZZLhJicuHb_MJBou2WWcsq=w640-h386" width="640" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖六】Fully automated RNA library-prep for clinical / research use.</td></tr></tbody></table><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgm6BiUUuEAERD_jxCSt_EaSuLk2WDJ1INO-uX9Ht3Ykj7iVQ080jX7AtbXuMn25fH-zpWEE8UrCE5JUdhmDp1szJr1iRfwYBNuR6t3BIzDiIAn0YZNNj4oKS259RyAAhe_VQglWKHo_Vl7-xj9AMm1mo_9gixYSuSQ2zgdsN-UBRqS2416haCQ_ne6=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="283" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgm6BiUUuEAERD_jxCSt_EaSuLk2WDJ1INO-uX9Ht3Ykj7iVQ080jX7AtbXuMn25fH-zpWEE8UrCE5JUdhmDp1szJr1iRfwYBNuR6t3BIzDiIAn0YZNNj4oKS259RyAAhe_VQglWKHo_Vl7-xj9AMm1mo_9gixYSuSQ2zgdsN-UBRqS2416haCQ_ne6=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖七】SureSelect FFPE RNA input optimized for targeted RNA-Seq.</td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;">2005-2006 的 NGS 興起,更是以極高效率做更多的癌種、病人樣品、全基因掃描融合基因的存在。NGS 除了鑑定出更多的融合基因外, 也因其高通量取樣定序能力,以及基因捕抓技術的配合,始得常規化的 RNA 臨床研究 / 診斷成為可能。</div><p style="text-align: left;"><br /><br /><b><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span></b><br />1. <a href="https://www.nature.com/articles/nbt.2024">https://www.nature.com/articles/nbt.2024</a><br />2. <a href="https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14737159.2021.1920399">https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14737159.2021.1920399</a><br />3. <a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7460167/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7460167/</a></p>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-8121664214450904632022-01-17T00:08:00.005-08:002022-01-19T22:59:30.401-08:00RNA fusion 實驗演進 ( 上 ) – 人類 48 條染色體 ?? "疏失" 推翻了錯誤認知,讓兩個年輕仔找到 "費城染色體",促使半世紀後進行癌症 RNA NGS 檢測<div style="text-align: left;">基因融合 ( gene fusion ) 為癌症突變中的一個重要變異,受限於癌症臨床樣品高降解 ( highly degraded )、微量 ( 1-30% tumor 含量 )、高細胞異質度 ( heterogeneous ) 等特性,加上 RNA 因表現量落差巨大 ( ~10^6 dynamic range ) 及複雜的序列剪接、融合 ( splicing、fusion ),基因融合一直以來多以 DNA 層次來分析,而非以 RNA 轉錄本 ( RNA transcript ) 來進行研究。隨著二代、三代定序技術的成熟,常規 NGS 實驗已能很好的解析 FFPE DNA、RNA 樣品,FFPE DNA 已能順利偵測存量 ~1% 的癌症單點突變 ( point mutation )、微片段突變 ( 30-50% 的外顯子層次 ( exon-level ) 增幅或缺失,而 FFPE RNA 樣品,也因 NGS 成本大幅下降與目標抓取 ( target capture ) 技術進步,得以針對目標基因 ( 如 kinase genes, kinome ) 的外顯子甚至是接合處 ( exon junction ),集中分析數億 ( hundreds of million ) 條 cDNA 片段,由 NGS big data 視角進行 資料-假設複合驅動 ( Data-Hypothesis-Driven ) 研究,搜尋新的剪接、融合現象。</div><div style="text-align: left;"><br />歷史中第一個被發現、也最為人所熟知的基因融合事件,當屬慢性骨髓性白血病 ( chronic myeloid leukemia, CML ) 常出現的 Chr9 與 Chr22 的長端區 ( q-arm ) 區段易位 ( translocation, t ( 9;22 ) ( q34;q11 ) ),該現象產生了 Chr22 變異染色體 - 費城染色體 ( the Philadelphia chromosome,簡稱 Ph ),以及易位斷點 ( breakpoint ) 處生成的 <i>bcr-abl1</i> ( 舊稱 <i>bcr-abl</i> ) 融合基因 <i><a href="https://www.nature.com/articles/1206080">17</a></i>。<span style="color: #ffa400;">( 圖一、二 )</span></div><div style="text-align: left;"><span style="color: #ffa400;"><br /></span></div><div style="text-align: left;"><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEj0f2dGz0hwGCQGE2dw5sB3U76UOa7PHSroqFqebF6-GkBChCooB025L9-OwhChusRiftjMdUbCIF2lfWC_wN7iY8uQ_jRrxBd3syoYWSteNwZxtN2sBahcJHClghbyLKsxWcQak8O-xx-1lFgH7zSQACMNqXJxfHjKyYdps3KG9ErMLGRE76tWoPh1=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="550" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEj0f2dGz0hwGCQGE2dw5sB3U76UOa7PHSroqFqebF6-GkBChCooB025L9-OwhChusRiftjMdUbCIF2lfWC_wN7iY8uQ_jRrxBd3syoYWSteNwZxtN2sBahcJHClghbyLKsxWcQak8O-xx-1lFgH7zSQACMNqXJxfHjKyYdps3KG9ErMLGRE76tWoPh1=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖一】Philadelphia chromosome ( from NCBI PQD <i><a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK65740/">28</a></i> )</td></tr></tbody></table><span style="color: #ffa400;"><br /></span><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEijb53DmuZJXDchtq8N66K1-aSKMWeklurnYJ7m0HlMrdUyG1jMvtKSvGH-lJsWxh6tJJ1G6ysiKd56Pj46gHwp7qYnf8XYNf8X7z8S_doopQ8l6HqX0BK2IO_DjUDEf5CEh5Uy1hTHadf3GBIbrAZAPmy08skddKGTHz2N1c4nlYV0yBsncsnO_lZn=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="466" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEijb53DmuZJXDchtq8N66K1-aSKMWeklurnYJ7m0HlMrdUyG1jMvtKSvGH-lJsWxh6tJJ1G6ysiKd56Pj46gHwp7qYnf8XYNf8X7z8S_doopQ8l6HqX0BK2IO_DjUDEf5CEh5Uy1hTHadf3GBIbrAZAPmy08skddKGTHz2N1c4nlYV0yBsncsnO_lZn=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖二】BCR gene and Bcr/Abl translocation products</td></tr></tbody></table><br /><br /><h3 style="text-align: left;"><b>Genomics Research History I ( 1882-1960 )</b></h3><div><b><br /></b></div>費城染色體發現與研究的技術,最早可追朔到 140 年前,得力於德國光學科技改良了顯微鏡成像,以及染色技術開發,德國科學家 Walther Flemming ( chromosome、chromatin 字詞創名者 ) 得以看見染成深色無細節、輪廓如燈刷的染色體 ( lampbrush chromosome ) ( 1882 手繪圖 )。雖然影像如此有限,但德國的科學家們開始觀察到許多惡性腫瘤的組織切片,具有可見的有絲分裂異常 ( gross mitotic abnormalities ) 現象。後於 1914 年時 Theodor Boveri 提出基因異常與癌症發展假說,第一次將腫瘤生成與基因不穩定變異連結起來,但此時因技術緣故,只能停留在粗略且吃力的觀察,連 1921 年美國科學家 Theophilus Shickel Painter 發表在 Science 期刊的人類染色體數量都不太確定,知道為 45 - 48 條之間 <i><a href="https://www.science.org/doi/10.1126/science.53.1378.503">1</a></i> , 隨後推定為 48 條,直到了 1956 年才由東爪哇裔科學家 Joe Hin Tjio 與瑞典科學家 Albert Levan 更正為 46 條 <i><a href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1601-5223.1956.tb03010.x">2</a></i>。而 1921-1956 的 35 年間因沒有正確基礎、沒有清晰觀察染色體技術、二戰影響下,未有明確的癌症染色體變異發現。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjfp_c9P1VyBlGG8gku4uAF_QT1gwOu98-RiNdI4id-8bolpVW23TsS6ReWVHQaSNItrwUOIpC81xBVa3azVM8rLyr8WYgxwqyyGl0An6BQsz2OocWd8BNiElpC7zppGUpfJ0lH5o7y3442WcHJTKXER5fQx92E-eKogh-ECdprc9pQ8lG-Oc2aK75W=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="342" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjfp_c9P1VyBlGG8gku4uAF_QT1gwOu98-RiNdI4id-8bolpVW23TsS6ReWVHQaSNItrwUOIpC81xBVa3azVM8rLyr8WYgxwqyyGl0An6BQsz2OocWd8BNiElpC7zppGUpfJ0lH5o7y3442WcHJTKXER5fQx92E-eKogh-ECdprc9pQ8lG-Oc2aK75W=s16000" /></a></div><br /><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><h3 style="text-align: left;">Genomics Research History II ( 1960-1980 )</h3><div><br /></div>科學的進步有時是偶然的,一次技術員調配疏失,使得華裔科學家 Tao-Chiuh Hsu ( 徐道覺 ) 發現低滲透壓鹽緩衝液可以使染色體舒展分散、非常漂亮的呈現,他於 1952 年發表了 Hsu's technique <i><a href="https://www.karger.com/Article/Abstract/78954">18</a></i>,促使了 Tjio & Levan 於 1956 年確定了正確的人類染色體數量 <i><a href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1601-5223.1956.tb03010.x">2</a></i>,正確的基礎加上技術突破,得以使染色體變異顯現,著名的唐氏症即於 1959 由法國醫生 Marthe Gautier 發現與三條 21 號染色體 ( Trisomy 21 ) 有關,以及在 1960 年迎來人類在癌症染色體上的明確變異發現 — 慢性骨髓性白血病 ( CML ) 的 費城染色體 ( the Philadelphia chromosome )。</div><div style="text-align: left;"><br />1956 年,年輕科學家 Peter Nowell ( 戴眼鏡者 ) 加入 University of Pennsylvania ( 簡稱 UPenn ) 進行白血病研究,Nowell 對細胞遺傳學一無所知,彼時 UPenn 內也無人對染色體研究感興趣,後來 Nowell 找到在 the Fox Chase Cancer Center 寫人類染色體論文的研究生 David Hungerfold,兩人一起應用當時最新的細胞、染色體製備技術 ( cell、chromosomal preparation ),觀察到 CML 腫瘤細胞存在微小染色體 ( minute chromosome ) <i><a href="https://www.scirp.org/(S(351jmbntvnsjt1aadkposzje))/reference/ReferencesPapers.aspx?ReferenceID=811708">3</a></i>;隔年 ( 1961 ) 在 Paul Moorhead 的幫助下改善技術後進一步發表發現,此後微小染色體依循染色體標準化委員會 ( the Committee for the Standardization of Chromosomes ) 的規定以發現地命名,定名為費城染色體 ( the Philadelphia chromosome,簡稱 Ph )。</div><div style="text-align: left;"><br />Ph 染色體的來源,則是在 7-10 年後因 quinacrine fluorescence 與 Giemsa banding 新技術開發,由美國科學家 Janet Rowley 於 1973 年鑑定出 Ph 染色體為 Chr9 與 Chr22 的區段易位 ( translocation, t ( 9;22 ) ) 所產生 <i><a href="https://www.nature.com/articles/243290a0">5</a></i>。這段時期,除了染色體技術外,mRNA 與 protein 的關係、RNA 的逆轉錄 ( reverse transcription ) 技術、南方墨點法 ( Southern DNA blotting )、分子選殖 ( molecular cloning, or 分子克隆 ) 技術也陸續發展,使得染色體的分析進入基因層次。而 Ph 染色體的進一步細節,則是 1977 年的革命創新 Sanger sequencing ( 一代 DNA 定序 ),以及新興的分子選殖 ( molecular cloning,又稱分子克隆 ) 技術於 1980 年代交會後,得以獲得解析。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhHJNlLNgSBPFc0x77DOJFms_oKF7jCrgyvQ2HjoEx2eMCacOsZZzW9__r9DglB_ok5FpdRIx0jY11JkBeQTSanvdank4DYjh2896mafZC5dbE2ZuHYLpCBGObeDceIf5_WuM9aeAo7lSinHC4g2VkbE_3CAPlodBz0XL7SeaPefxj0UomhFdYR87v4=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="515" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhHJNlLNgSBPFc0x77DOJFms_oKF7jCrgyvQ2HjoEx2eMCacOsZZzW9__r9DglB_ok5FpdRIx0jY11JkBeQTSanvdank4DYjh2896mafZC5dbE2ZuHYLpCBGObeDceIf5_WuM9aeAo7lSinHC4g2VkbE_3CAPlodBz0XL7SeaPefxj0UomhFdYR87v4=s16000" /></a></div><br /><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><h3 style="text-align: left;">Genomics Research History III ( 1980-1990 )</h3><div><br /></div><div>分子生物學在 1980 年代快速進步,目前常用的經典分子生物學技術幾乎都在這個時期出現,也讓 bcr-abl 融合基因被鑑定出來。</div><div><br /></div>1982 年時 Klein et al. 使用 Abelson murine leukemia virus ( A-MuLV ) 產生的 <i>v-abl</i> 基因探針 ( DNA probe ),加上限制酶定位法 ( restriction mapping ) 做出人類 <i>c-abl</i> 探針,以南方墨點法確認人類 <i>abl</i> 基因不在正常的 Chr9 位置上 ( 9q+ ),而是出現於易位後的 Ph 染色體 ( 22q- ) <i><a href="https://www.nature.com/articles/300765a0">7</a></i>, <i><a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC369769/">8</a></i>。</div><div style="text-align: left;"><br />1984 年同一團隊利用一段 Ph 的易位斷點區片段 ( the Philadelphia ( Ph' ) translocation breakpoint domain ) 作為探針,釣出 Chr22 上對應的一段 5.8 kb 斷點片段,稱呼它 " breakpoint cluster region " ( bcr ) <i><a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6319012/">10</a></i>,此時還不知道 bcr 是否為基因。接著該團隊以該 5.8 kb 片段做探針釣出了 cDNA,該 cDNA 存在一個蛋白質的 C-terminal end 部分,再以該 cDNA 作為探針,確定出易位斷點相對於外顯子的位置,顯示易位斷點是發生在內含子 ( intron ),由於該基因與此前分離的其他基因沒有同源性,因此被命名為 bcr 基因,此後使用 abl 和 bcl 的探針分析了 CML 病人的 RNA,證明了嵌合 BCR / ABL mRNA 存在 <i><a href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM198512053132301">11</a></i>。</div><div style="text-align: left;"><br />1986 年,Mes-Masson et al. 利用將數個 cDNA clones 進行定序,拼湊出完整的 Bcr-Abl 編碼序列 ( complete coding sequence ) <i><a href="https://www.pnas.org/content/83/24/9768">12</a></i>。有了 coding 序列之後,搭配 1983 年發明的 PCR 基因增幅技術,於 1988 年產生針對 fusion RNA 的 RT-PCR 診斷應用 <i><a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3165197/">14</a></i>,至此 Ph 染色體的本質,以及融合處生成的 bcr-abl1 ( 舊稱 bcr-abl ) 融合基因的完整 mRNA 編碼序列,已大致釐清。相對於 mRNA 的完整編碼序列在 1986 年已獲得,因染色體斷點落在富含重複序列 Alu repeat element 的 intron 上,直到 1995 年用霰彈法 ( shotgun strategy ) 定序完成數個易位斷點區的 cosmid 與 plasmid clones 的 DNA 序列,靠著比對各 clones 對應的 cDNA 序列,才將大致的 <i>abl</i> 與 <i>bcr</i> 完整基因定序出來,完成斷點準確定位,而斷點準確定位後也發現不同 CML 病人的 DNA 斷點沒有一致性 <i><a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7665185/">15</a></i>。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEho-tp13WO0d0_zQoeQ1dEFkUZD4gYCCvp55owz_oanKELuCV83uE75lCSWl5QLyyrqr6TxwbKrHHMb1vlrHVZkgh-M12tu4v_M1f75ukOKMTH1owyH7hspp-ni-C08giwpJMvU1XOkl9Z7fbQk9Te_HThrdEglP_1DupJ1ImAV4fT6frZAEu7qNuin=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="531" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEho-tp13WO0d0_zQoeQ1dEFkUZD4gYCCvp55owz_oanKELuCV83uE75lCSWl5QLyyrqr6TxwbKrHHMb1vlrHVZkgh-M12tu4v_M1f75ukOKMTH1owyH7hspp-ni-C08giwpJMvU1XOkl9Z7fbQk9Te_HThrdEglP_1DupJ1ImAV4fT6frZAEu7qNuin=s16000" /></a></div><br /><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><h3 style="text-align: left;">Genomics Research History IV ( 1990-2010 )</h3><div><br /></div>1990 年之後,得力於 Sanger 定序的改進以及電腦應用的進步,有越來越多的融合基因被找到 <i><a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24206917/">26</a></i>,同時也使人類基因體計畫 ( Human Genome Project, HGP ) 成為可行,並於 2001 取得第一份人類基因圖譜,這個時期技術著重在微小化、提升通量,因此毛細管 Sanger 定序儀與生物晶片 ( micro-array ) 於 1995 年後進入應用,而這兩個技術也進行了技術融合,10 年間將定序的 PCR、螢光偵測微縮在 microarray 上進行,於 2005-2006 成為了 NGS ( Next Generation Sequencing,次世代定序 ),同時生物晶片所用的高通量探針合成 ( probe synthesis ) 技術,也轉化為外顯子體、基因抓取 ( Exome、Gene capture ) 所用探針,於 2009 由 Agilent Technologies 與 Broad Institute 合作用於 fusion transcripts 的 RNA 抓取定序 <i><a href="https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-10-163">22</a></i> <i><a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19835606/">23</a></i> <i><a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19136943/">24</a></i>。自此,RNA fusion 研究進入以 NGS 技術為主的時代。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhLRA0cM9MOEh2YkG3Bpee7fsZ-YOvu_l5uun4ALh2l8GZb6gWvPhTBXxcNmcCT5CYY7jRJgjH9WoJ3xIMWq84HVA27iwc4Fb7uDEG8w1LajG6pXxyFnVCWBFFf0uMgwHtTavprmPcsWl4VLOXavrb-sqo9GhGNJuuaG_ReEb1KUBeJlZfqeaW0dw8E=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="537" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhLRA0cM9MOEh2YkG3Bpee7fsZ-YOvu_l5uun4ALh2l8GZb6gWvPhTBXxcNmcCT5CYY7jRJgjH9WoJ3xIMWq84HVA27iwc4Fb7uDEG8w1LajG6pXxyFnVCWBFFf0uMgwHtTavprmPcsWl4VLOXavrb-sqo9GhGNJuuaG_ReEb1KUBeJlZfqeaW0dw8E=s16000" /></a></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"></div><div style="text-align: left;"></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhPV-K5Eq-wz8LFSF_dw1mOSsAPlBrCMPUy3IHvjWPLrxBAKelJjO0MxL-Iysr1yDotXRAZs9vj1edNWw6Zfk79nXekRCbhu3RkAIP1j8R2yo5EtEc4YUqCLRY36mPFAHP3_tb_W00Norg6WYkMnRRiUA_zuae6Rns23PKN6xHxoFNQgjDmI_ojtXpP=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="378" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEhPV-K5Eq-wz8LFSF_dw1mOSsAPlBrCMPUy3IHvjWPLrxBAKelJjO0MxL-Iysr1yDotXRAZs9vj1edNWw6Zfk79nXekRCbhu3RkAIP1j8R2yo5EtEc4YUqCLRY36mPFAHP3_tb_W00Norg6WYkMnRRiUA_zuae6Rns23PKN6xHxoFNQgjDmI_ojtXpP=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖三】Discovery of fusion coincides with improved DNA sequencing technologies. ( From Ref 26 )</td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEi3bXEZ0meE-tljf0KJKKeafO84M_V_ZsgU_ZdXx015kP0OsW3HN2nwc9EXaT7BQ9iJDkghsf_S0RHYwcSQKggltrjo0bLlmMm-RQc-2Nw26xryJbSh3t7ox4shJbZJFboa52yXfAwfSoHwRc5CyNF8oGp55mmhRfO9VDREM8rq9LEuVV4JXs60PgLl=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="637" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEi3bXEZ0meE-tljf0KJKKeafO84M_V_ZsgU_ZdXx015kP0OsW3HN2nwc9EXaT7BQ9iJDkghsf_S0RHYwcSQKggltrjo0bLlmMm-RQc-2Nw26xryJbSh3t7ox4shJbZJFboa52yXfAwfSoHwRc5CyNF8oGp55mmhRfO9VDREM8rq9LEuVV4JXs60PgLl=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖四】Fusion genes and their methods of discovery. ( From Ref 26 )<br /><div style="text-align: left;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEh3bMg8Jj0qTqMxjDuU3A6LQvuXYCYB8-P1bddrPDDFw1gJBZ663vZ1OGRTn23qyNO1TGtFIPAnRp2Ooi7C_3oUhCDoQEbViAvczKaSCdf3hJWpjFqaxhYVuFBaYp-EgtO-rAptGPNtTKbKmSJV4TfwGEWAEVJFRdrtO22K4mXjvEY8s5alVfWVCA9G=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="641" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEh3bMg8Jj0qTqMxjDuU3A6LQvuXYCYB8-P1bddrPDDFw1gJBZ663vZ1OGRTn23qyNO1TGtFIPAnRp2Ooi7C_3oUhCDoQEbViAvczKaSCdf3hJWpjFqaxhYVuFBaYp-EgtO-rAptGPNtTKbKmSJV4TfwGEWAEVJFRdrtO22K4mXjvEY8s5alVfWVCA9G=s16000" /></a></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;">【圖五】Fusion location in the human body ( From Ref 26 )</div><br /><div style="text-align: left;"><br /></div></td></tr></tbody></table>回顧這段 128 年歷程,幾個概念值得參考:<br />a. 技術發展帶動了科學的前進<br />b. 技術突破更正了錯誤的已知,促使新的發現<br />c. 領域重大發現通常在技術突破後 5-10 年間發生<br />d. DNA 好取得所以先分析,但因為基因融合的 DNA 斷點處需要克服 repeat elements 與不固定問題,反而斷點精確定位是最晚完成的<br />e. RNA ( cDNA ) 因在 splicing 過程把 repeat-rich 的 intron 丟掉,而且有較為固定的 exon-exon junction,只要能釣出 RNA 就成功一半<br />f. 1982-1986 間的 Bcr-Abl 鑑定工作,用到許多 cDNA probe 釣序列、片段定位、序列解析,這與 2022 年使用的 RNA capture + NGS 定序實驗概念一模一樣</div><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;">下一篇,我們來看 2022 年的現在是如何進行 RNA fusion 研究與診斷 <i><a href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40142-021-00199-x">27</a></i><br /></div><div style="text-align: left;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://upload.cc/i1/2022/01/14/ZWsMQD.jpg?r=642536183" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;" target="_blank"><img border="0" data-original-height="226" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEi1MUYt7OJQuN9b1Q-TjtBrzqatBA04paTZ3wIx8lvonbQUULAcbV-o3Wj0qyh5L4QGFsI3LP1ngkd-gU_m0EyPUpWe6k6yY4yt5Yf9sOIxkWIx4nRRj5mRT3xVxseJT0XxLGStIGNwDv5-scz73cYOHJJLEYd1cpxtFEQYAAkKPajUWXOTkS87PeSR=s16000" /></a></div><br /><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><span style="color: #ffa400;"><b>【參考資料】</b></span></div><div style="text-align: left;"><div>1. Painter TS. (1921) “<a href="https://www.science.org/doi/10.1126/science.53.1378.503">THE Y-CHROMOSOME IN MAMMALS.</a>” <b><i>Science.</i></b> 53(1378):503-4. </div><div><br /></div><div>2. JOE HIN TJIO, ALBERT LEVAN. (1956) “<a href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1601-5223.1956.tb03010.x">THE CHROMOSOME NUMBER OF MAN</a>” <b><i>Hereditas.</i></b></div><div><br /></div><div>3. P. C. Nowell and D. A. Hungerford (1960) “<a href="https://www.scirp.org/(S(351jmbntvnsjt1aadkposzje))/reference/ReferencesPapers.aspx?ReferenceID=811708">A Minute Chromosome in Human Chronic Granulocytic Leukemia</a>” <b><i>Science.</i></b> Vol. 132, 1960, p. 1497.</div><div><br /></div><div>4. Jackson DA, Symons RH, Berg P. (1972) “<a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/4342968/">Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli.</a>” <b><i>Proc Natl Acad Sci U S A.</i></b> 69(10): 2904–2909.</div><div><br /></div><div>5. ROWLEY, J. (1973) “<a href="https://www.nature.com/articles/243290a0">A New Consistent Chromosomal Abnormality in Chronic Myelogenous Leukaemia identified by Quinacrine Fluorescence and Giemsa Staining.</a>” <b><i>Nature</i></b> 243, 290–293. </div><div><br /></div><div>6. KOTTLER, MALCOLM JAY. (1974) “FROM 48 TO 46: CYTOLOGICAL TECHNIQUE, PRECONCEPTION, AND THE COUNTING OF HUMAN CHROMOSOMES.” Bulletin of the History of Medicine. Vol. 48, No. 4: 465-502</div><div><br /></div><div>7. de Klein A, van Kessel AG, Grosveld G, Bartram CR, Hagemeijer A, Bootsma D, Spurr NK, Heisterkamp N, Groffen J, Stephenson JR. (1982) “<a href="https://www.nature.com/articles/300765a0">A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia.</a>” <b><i>Nature</i></b> 300, 765-767. </div><div><br /></div><div>8. Okayama H, Berg P. (1982) “<a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC369769/">High-efficiency cloning of full-length cDNA.</a>” <b><i>Mol Cell Biol.</i></b> 2(2): 161–170.</div><div><br /></div><div>9. Heisterkamp, N., Stephenson, J., Groffen, J. et al. (1983) “<a href="https://www.nature.com/articles/306239a0">Localization of the c-abl oncogene adjacent to a translocation break point in chronic myelocytic leukaemia.</a>” <b><i>Nature</i></b> 306, 239–242.</div><div><br /></div><div>10. Groffen J, Stephenson JR, Heisterkamp N, de Klein A, Bartram CR, Grosveld G. (1984) “<a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6319012/">Philadelphia chromosomal breakpoints are clustered within a limited region, bcr, on chromosome 22.</a>” <b><i>Cell</i></b> 36(1):93-9.</div><div><br /></div><div>11. Stam K, Heisterkamp N, Grosveld G, de Klein A, Verma RS, Coleman M, Dosik H, Groffen J. (1985) “<a href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM198512053132301">Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome.</a>” <b><i>N Engl J Med.</i></b> 313:1429-1433</div><div><br /></div><div>12. Mes-Masson AM, McLaughlin J, Daley GQ, Paskind M, Witte ON. (1986) “<a href="https://www.pnas.org/content/83/24/9768">Overlapping cDNA clones define the complete coding region for the P210c-abl gene product associated with chronic myelogenous leukemia cells containing the Philadelphia chromosome.</a>” <b><i>Proc Natl Acad Sci U S A.</i></b> 83(24):9768-72.</div><div><br /></div><div>13. Hermans A, Heisterkamp N, von Linden M, van Baal S, Meijer D, van der Plas D, Wiedemann LM, Groffen J, Bootsma D, Grosveld G. (1987) “<a href="https://www.cell.com/fulltext/0092-8674(87)90007-9">Unique fusion of bcr and c-abl genes in Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia.</a>” <b><i>Cell</i></b> 51(1):33-40.</div><div><br /></div><div>14. Kawasaki ES, Clark SS, Coyne MY, Smith SD, Champlin R, Witte ON, McCormick FP. (1988) “<a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3165197/">Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro.</a>” <b><i>Proc Natl Acad Sci U S A.</i></b> 85(15):5698-702.</div><div><br /></div><div>15. Chissoe SL, Bodenteich A, Wang YF, Wang YP, Burian D, Clifton SW, Crabtree J, Freeman A, Iyer K, Jian L, et al. (1995) “<a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7665185/">Sequence and analysis of the human ABL gene, the BCR gene, and regions involved in the Philadelphia chromosomal translocation.</a>” <b><i>Genomics.</i></b> 27(1):67-82.</div><div><br /></div><div>16. Jeffs AR, Benjes SM, Smith TL, Sowerby SJ, Morris CM. (1998) “<a href="https://academic.oup.com/hmg/article/7/5/767/755697">The BCR gene recombines preferentially with Alu elements in complex BCR-ABL translocations of chronic myeloid leukaemia.</a>” <b><i>Hum Mol Genet.</i></b> 7(5):767-76.**</div><div><br /></div><div>17. Heisterkamp N, Groffen J. (2002) “<a href="https://www.nature.com/articles/1206080">Philadelphia-positive leukemia: a personal perspective.</a>” <b><i>Oncogene.</i></b> 21(56):8536-40.</div><div><br /></div><div>18. Pathak S. (2004) “<a href="https://www.karger.com/Article/Abstract/78954">T.C. Hsu: In memory of a rare scientist</a>” <b><i>Cytogenet Genome Res</i></b> 105:1–3</div><div><br /></div><div>19. Gartler SM. (2006) “<a href="https://www.nature.com/articles/nrg1917">The chromosome number in humans: a brief history.</a>” <b><i>Nat Rev Genet.</i></b> 7(8):655-60.**</div><div><br /></div><div>20. Nowell PC. (2007) “<a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1934591/">Discovery of the Philadelphia chromosome: a personal perspective.</a>” <b><i>J Clin Invest.</i></b> 117(8):2033-5.**</div><div><br /></div><div>21. Timothy J. Ley, Elaine R. Mardis et al. (2008) “<a href="https://www.nature.com/articles/nature07485">DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome.</a>” <b><i>Nature.</i></b> 456(7218):66-72.**</div><div><br /></div><div>22. Guffanti A et al. (2009) “<a href="https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-10-163">A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing.</a>” <b><i>BMC Genomics.</i></b>10:163.</div><div><br /></div><div>23. Levin JZ, Berger MF, Adiconis X, Rogov P, Melnikov A, Fennell T, Nusbaum C, Garraway LA, Gnirke A. (2009) “<a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19835606/">Targeted next-generation sequencing of a cancer transcriptome enhances detection of sequence variants and novel fusion transcripts.</a>” <b><i>Genome Biol.</i></b> 10(10):R115.</div><div><br /></div><div>24. Maher CA, Kumar-Sinha C, Cao X, Kalyana-Sundaram S, Han B, Jing X, Sam L, Barrette T, Palanisamy N, Chinnaiyan AM. (2009) “<a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19136943/">Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer.</a>” <b><i>Nature.</i></b> 458(7234):97-101.</div><div><br /></div><div>25. Knutsen T. (2011) “<a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21430353/">The Philadelphia chromosome: celebration of the 50th anniversary of its discovery.</a>” <b><i>J Assoc Genet Technol.</i></b> 37(1):5-10.**</div><div><br /></div><div>26. Parker BC, Zhang W. (2013) “<a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24206917/">Fusion genes in solid tumors: an emerging target for cancer diagnosis and treatment.</a>” <b><i>Chin J Cancer.</i></b> 32(11):594-603.</div><div><br /></div><div>27. Curry PDK, Broda KL, Carroll CJ. (2021) “<a href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40142-021-00199-x">The Role of RNA-Sequencing as a New Genetic Diagnosis Tool.</a>” <b><i>Current Genetic Medicine Reports.</i></b> 9(2):13-21.</div><div><br /></div><div>28. 圖一: <a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK65740/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK65740/</a></div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-23116923662218082922022-01-03T18:00:00.001-08:002022-01-03T18:00:00.221-08:00多 -plex 混抓 Exome,如何 "真省錢、無代價" ?<div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjU1ngZxqNjarQh0kzyZYj0En7SWpzDq7yXVeUZlsKCqak8SxRJcDGiruNiLdlhIkGcInLMHU1KjFtOPDdVEmKuTzZLWXk994HTvOX40HvhtvyzWc4QV4Pjhs5ZmmeDqigqmI0QyCz9L7lULjRleR6uLPDBxHHf8P2t3eFZ76jr1xtiKWTHCs9cdyBk=s800" imageanchor="1" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="534" data-original-width="800" height="268" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjU1ngZxqNjarQh0kzyZYj0En7SWpzDq7yXVeUZlsKCqak8SxRJcDGiruNiLdlhIkGcInLMHU1KjFtOPDdVEmKuTzZLWXk994HTvOX40HvhtvyzWc4QV4Pjhs5ZmmeDqigqmI0QyCz9L7lULjRleR6uLPDBxHHf8P2t3eFZ76jr1xtiKWTHCs9cdyBk=w400-h268" width="400" /></a></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><br /></div>次世代定序發展至今,其技術已進入穩定、成熟的階段,如何有效控制整個 NGS 流程 — 從樣本到結果的實驗成本並確保最佳的實驗效能,是下一步努力改進的課題。深入探討 NGS 實驗各個成本可控的環節: </div><div><br /></div><div><b>1.樣品條件:</b>起初的樣品破碎或不易取得,將會大幅提升後續處理難度,影響操作通量,時間成本增加</div><div><br /></div><div><b>2.基因抓取內容:</b>探針設計與製備試劑成本反映於預計分析的基因區域,與該抓取範圍大小及序列複雜性有關</div><div><br /></div><div><b>3.定序分析:</b>取決於實驗的數據量多寡、定序深度需求,以及分析設備、軟體執行的成本</div><div><br /></div><div>隨著不同實驗屬性,以上成本控制條件尚需做更複雜的改進調整,才能讓每一次的實驗達到最佳化,現階段,為使臨床 WES 研究更經濟、省成本,方便大量操作,提升定序通量、簡化操作流程是最直接、相較單純、經濟化的改善方式,現今多以混樣 ( pooling ) 處理 NGS 樣品建庫來降低實驗成本。</div><div><br /></div><div>WES 常見應用為癌症、遺傳,由於兩者實驗條件差異,適當選擇建庫混樣法,可獲得更有效益的結果。癌症基因定序的特性:樣品異質性高、臨床樣品 ( FFPE ) 完整性差,而需要定序靈敏度更高,才可以看到真實的基因訊息;而遺傳基因檢測的特質:樣品量與品質需求標準較低,只要具備 50% 突變的偵測力,可容忍較低的定序靈敏度;不同的混樣法會影響後續定序表現,因此,建庫 pooling 方法就顯得十分重要。</div><div><br /></div><h2 style="text-align: left;"><b><span style="color: #0085d5;">捕抓建庫 pooling 方法</span></b></h2><div style="text-align: left;"><b><br /></b></div><div style="text-align: left;"><b>▶ Post-capture pooling:</b></div><div style="text-align: left;"><b><br /></b></div><div style="text-align: left;"><div><b>一個樣品對應一份探針,</b>讓探針與樣品進行雜合反應後,不同序列的 sample index 加到每個樣品的文庫上完成建庫,QC 合格的文庫再根據定序數據量的需求混合後,上機定序。</div><div><br /></div><div>每個樣品與探針分別雜合捕抓,可盡量高度保留每一個文庫的複雜度,特別適合於低頻率突變的偵測,在定序前各樣品都先經過 QC,有效控管其文庫製備的品質,只要不符實驗標準,立即重做,雖然步驟繁複許多,在上機前的混樣,可保持每個樣品的數據量均一,或靈活調整樣品濃度來控制不同的定序量,是較容易預期結果的混樣方式,有助於降低上機定序的失誤率,並能有限度地控制成本。</div><div><br /></div><div><br /></div><div><b>▶ </b><b>Pre-capture pooling:</b></div><div><b><br /></b></div><div><div><b>多個樣品對應同一份探針。</b>不同的 sample index 在雜合、捕抓前分別加到每個樣本上,QC 合格的樣品進行等量混樣後,每個混樣 pool 共用一份探針進行雜合捕抓,再上機定序。</div><div><br /></div><div>共用探針、或探針不足時,各自製備的文庫複雜性較低,duplication 比率隨之提高,影響低頻率變異的偵測效能;且樣品彼此間雜合效率會有差異,導致每個樣品的定序數據量容易不均,難以預期、控制實驗結果,最後反而增加定序成本。Pre-capture pooling 的優勢在於成本更低,合併捕抓讓操作通量提升,較適合樣品間差異性低、或長期經驗累積下,已可確保達到基本定序要求的實驗。</div><div style="font-weight: bold;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEiQUut6Dbut_ZfFImM0duwu9Bx0Qx2jZrD1kUQF-WjA_XEMMh6q6FhDI2LsrPMsulA86_AIkhIsGqs3BetrVQ-03LvVPeOyGQGh811YpKbg8pbrC4RKOr90fnd9x1lxD3NegUkeG-32gF_MmGFVP1h7qghIPPlZNOkYjiiaSXY_AoRNrmnHZCzjTMjk=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="203" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEiQUut6Dbut_ZfFImM0duwu9Bx0Qx2jZrD1kUQF-WjA_XEMMh6q6FhDI2LsrPMsulA86_AIkhIsGqs3BetrVQ-03LvVPeOyGQGh811YpKbg8pbrC4RKOr90fnd9x1lxD3NegUkeG-32gF_MmGFVP1h7qghIPPlZNOkYjiiaSXY_AoRNrmnHZCzjTMjk=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖一】post-capture pooling 與 pre-capture pooling 示意圖</td></tr></tbody></table><br /><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgdRCHvD-r4TbhJFa96Nu4Wugf8BPL03Gp2r8rhkfZZVKtmWgSHTgyHGvVeO23I2KYNmKevT5Awmp67TeJJAShd6RqKO4rH5b8fI0nlbUEVSuyeg-Kb0Pv48100GvxTNwF6K_Q6aUJo4CsCQVFtpFxTQYdBTGQOTFdYQmj07RirnSinA1TSoWdO75nr=s800" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="414" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgdRCHvD-r4TbhJFa96Nu4Wugf8BPL03Gp2r8rhkfZZVKtmWgSHTgyHGvVeO23I2KYNmKevT5Awmp67TeJJAShd6RqKO4rH5b8fI0nlbUEVSuyeg-Kb0Pv48100GvxTNwF6K_Q6aUJo4CsCQVFtpFxTQYdBTGQOTFdYQmj07RirnSinA1TSoWdO75nr=s16000" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖二】Post-capture pooling 和 pre-capture pooling 對定序數據均一性影響的差異。前者的均一性顯著優於後者</td></tr></tbody></table><div style="font-weight: bold;"><br /></div><div><div>Post-capture / Pre-capture pooling 不同的技術特性,影響 NGS 樣品製備效果及後續的定序表現,<b><span style="color: #ffa400;">在定序量大、少量樣品、急件進行的情況下,Post-capture</span></b></div><div><b><span style="color: #ffa400;">pooling 是一種更穩定、可靠和靈活的 Exome lib prep 方法</span></b>;平衡成本與提升通量的需求時,則可斟酌使用 Pre-capture pooling。</div><div style="font-weight: bold;"><br /></div><div style="font-weight: bold;"><br /></div><div><b>▶ </b><b>post-capture pooling 使用時機:</b></div><div><b><br /></b></div><div><div><b>• 高深度定序檢測低頻率變異。</b>文庫複雜度高,較不易遺漏稀有變異位點;採用 pre-capture pooling,其文庫複雜度低,更可能遺漏、偵測不到突變而實驗失敗重做,增加定序成本。</div><div><br /></div><div><b>• 品質差的樣品,如降解程度較高的 FFPE 樣品。</b>完整性差的樣品在定序數據上的均勻度低,獨立捕抓製備文庫能盡量保留每個樣品基因訊息。</div><div><br /></div><div><b>• 樣品來源多樣或品質不一致。</b>為了讓樣品間的數據差距不要太大、或保有基本的數據量,通常利用 post-capture pooling 先將每個樣品獨立捕抓建庫再混樣上機,才能有效保留並分析樣品的基因訊息。</div><div style="font-weight: bold;"><br /></div><div style="font-weight: bold;"><br /></div><div><b>▶ </b><b>pre-capture pooling 使用時機:</b></div><div><b><br /></b></div><div><div>• 高品質、充足的樣品量,同時檢測的目標區域較不具挑戰性;</div><div>• 滿足高品質、量充足條件的樣品,同時對資料要求較不嚴苛時。</div><div><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgbxKDKUTX7vIydCWe7kGoJ4YZBCP9Ag5UuorYwdbT4V3Kcela9BvC_1RPb1aTlrgxLyCIW_q3ZADGlNzHtOC7-lA31Vz-pPJUJINrxVbk9hBf6zX3cQnaf8ctVgqMmqXlGyiSjknFIMnr9Hz7iS1fBTnZcbrRFeebItcqpyk_fnY18jl8dhjBdxK7-=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="290" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEgbxKDKUTX7vIydCWe7kGoJ4YZBCP9Ag5UuorYwdbT4V3Kcela9BvC_1RPb1aTlrgxLyCIW_q3ZADGlNzHtOC7-lA31Vz-pPJUJINrxVbk9hBf6zX3cQnaf8ctVgqMmqXlGyiSjknFIMnr9Hz7iS1fBTnZcbrRFeebItcqpyk_fnY18jl8dhjBdxK7-=s16000" /></a></div><br /><div><div>不論 Post-capture pooling 或 Pre-capture pooling,只要符合實驗目的需要的定序表現 / 規格,取得充分、完整的基因資訊,都是可行、可選擇的方法。依據樣品條件、操作穩定性、定序數據需求等綜合考量,挑選相應合適的 Pooling 方法,別為了節省前端的製備成本而犧牲最後定序結果的可靠性,才是真正省下成本、獲得有應用價值結果的最佳選擇。</div><div><br /></div><div>SureSelect 全外顯子第八代,推出日常基礎 WES 分析 ( Exome V8 )、轉譯醫學 ( Exome V8 + UTR )、臨床研究應用 ( Exome V8 + NCV ),每一種探針應用皆提供 Post-capture / Pre-capture 混樣的試劑組,並能進行自動化 exome 文庫製備,讓每一個 WES 實驗都能穩定、輕鬆、省錢。</div><div><br /></div></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjFQCKsSm2-lX631ztCptQQ78iLNuZbbX8lWOjR3hec2G7H7KAbykQSL_A6fYTWhd35jk0URo_foM2klI2uZWOoRKBIdyO50_2AkOsRmGVHgfcwRT3JsN5FJ4KnVipQpT8g-4v5vxA0dtoJTbjGSVgkFfduIEhuzq4DTiThjD0hZN7_G3bh6umiclHy=s800" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="620" data-original-width="800" height="496" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/a/AVvXsEjFQCKsSm2-lX631ztCptQQ78iLNuZbbX8lWOjR3hec2G7H7KAbykQSL_A6fYTWhd35jk0URo_foM2klI2uZWOoRKBIdyO50_2AkOsRmGVHgfcwRT3JsN5FJ4KnVipQpT8g-4v5vxA0dtoJTbjGSVgkFfduIEhuzq4DTiThjD0hZN7_G3bh6umiclHy=w640-h496" width="640" /></a></div><div style="font-weight: bold;"><br /></div></div></div></div></div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5354344860308060790.post-11405144002611117452021-11-04T23:30:00.002-07:002021-11-05T00:01:37.035-07:00RNA Fusion - 癌症研究關鍵下一步<div style="text-align: left;"><div style="text-align: left;"><div style="text-align: left;"><div style="text-align: center;"><img border="0" data-original-height="533" data-original-width="800" height="266" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi2UZiBEwm0XeZqRYpOSbsAAxGlk5vEAB-UT6GUZw3kC2sMJk8TTjAL4suV3bK7DIgxR52ZjH4d3VWX0rFezvCoXEm7vhCu_6XnP4nt2t0WXbSieCZgcX_tGA4cg1VF7l10nshnbL61kRs/w400-h266/BLOG.jpg" width="400" /></div><div style="text-align: left;"><br /></div>自從次世代基因定序 ( NGS ) 技術成熟後,癌症臨床研究即廣泛採用 Cancer Panel、WES、WGS 等基因定序技術,並應用 NGS 高靈敏度特性,將以往的檢體 ( biopsy ) 限制加以突破,並推展至液態活檢 ( liquid biopsy ) 應用。這些癌症臨床研究的新高度,主要是以「DNA」為分析標的,DNA 因化學穩定性、組織一致性、套數變動性 ( dynamic range of copy number ) 等特性,能在複雜的臨床流程下保有分析鑑別性,自過往的大型研究中累積齊全的突變資料,使得 DNA 定序成為近年精準醫學主流。<br /><br /></div><div style="text-align: left;">然而 NGS 技術帶來的突破並未停歇,而是繼續由其他角度提升癌症解析層次。綜觀所有癌症檢測,醫院日常進行的臨床病理 IHC、FISH 實驗,應為數量體最龐大、驗證充足、臨床經驗豐富的經典癌症檢測,這兩個技術多用於直接檢測蛋白質的表現量,或間接評估染色體變異引發的蛋白質融合,由此可知醫院日常的癌症檢測基礎是「蛋白質」。雖然 NGS 技術未能直接測定蛋白質,但 NGS 能夠自一個樣品中定序出數億條的序列 ( hundreds of millions of reads per sample ),這樣的能力再搭配上發展成熟的目標增幅 ( target enrichment ) 技術,使癌症醫學得以處理 RNA 降解嚴重、序列多變、數量落差問題,以高解析度方式間接評估蛋白質表現量或融合,建立更全面性的 DNA translocation -- RNA fusion -- Protein fusion 生物中心法則 ( central dogma ) 連結。因此國際上的大型癌症研究計畫,例如歷時 13 年多 ( 2005-2018 ) 的 TCGA ( The Cancer Genome Atlas ) 計畫,或是 2004-2015 致力於 Glioblastoma transcriptome data ( RNA-Seq ) 的 the GLIOCAT study,皆將 NGS RNA-seq 列入數據蒐集環節,並於計畫後源源不斷找出新的連結。<br /><br /></div><div style="text-align: left;">若以 TCGA 計畫為例 <span style="color: #ffa400;">( 圖一 )</span>,相關研究顯示近 16.5% 癌症的發生與基因融合 ( gene fusion ) 密切相關 <a href="https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(18)30395-4?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124718303954%3Fshowall%3Dtrue"><i><b>1</b></i></a>,並鑑定出 6% 案例具可用藥性,透過基因融合轉譯產物 ( RNA fusion transcripts ),直接檢測 fusion gene 轉錄 / 表現能力,比定序整個基因體 DNA 更快速找出變異,有利了解 fusion RNA expression 對癌細胞的影響。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align: center;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgUSyiGziIqvUNvIJr3u9tafo9hhj2_J4l7CFvN8ld8kIFOl0pb3NDsQGOFKdJI5WzEOR1z7vpF8A_q016SCb2YxXfB6K_xVKlpKZXp9O4yqAnyA_wAOiIim42tLz9Qje68D00Fk1a8P2A/s800/PIC_1.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="370" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgUSyiGziIqvUNvIJr3u9tafo9hhj2_J4l7CFvN8ld8kIFOl0pb3NDsQGOFKdJI5WzEOR1z7vpF8A_q016SCb2YxXfB6K_xVKlpKZXp9O4yqAnyA_wAOiIim42tLz9Qje68D00Fk1a8P2A/s16000/PIC_1.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【圖一】Driver Fusions and Their Implications in the Development and Treatment of Human Cancers</td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;">因 RNA fusion 對癌症醫學的重要性不言可喻,近年精準醫學檢測也開始導入 NGS RNA fusion 定序,並由臨床實證中顯示其諸多特點 <a href="https://www.annalsofoncology.org/article/S0923-7534(19)45992-9/fulltext"><b><i>2</i></b></a> <span style="color: #ffa400;">( Table1 )</span>:</div><div style="text-align: left;"><br /><b>( 1 ) 更全面了解對癌症的影響</b><br />一次實驗可偵測所有發生 gene fusion 的區域、基因重排的變異狀況、基因異常表現情形。</div><div style="text-align: left;"><br /><b>( 2 ) 可用於 liquid biopsy 樣品</b><br />組織檢體難取得、不易處理,因此血液樣品中的 cell free RNA 是更方便的檢體類型。</div><div style="text-align: left;"><br /><b>( 3 ) 高準確度 ( sensitivity & specificity )、高通量</b><br />在成本經濟與實驗便利的條件下,讓臨床獲得更充足、有效的癌症基因訊息。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><div class="separator" style="clear: both; text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjF7Rt7Q1Cet5Y4Pd_RrJ7mA1qLhUZ6HS6OvYh_T8KUWDV62zW0_-Bu8sSPi6GmZPnAxiqGzKg9z-GJF2JMAebOmbAWrMIECRHCZl_brCLJxPjFf5H-Q7Z4ZKbHqKRX8QWcnMNLGiC0VkI/s800/PIC_2.jpg" style="margin-left: 1em; margin-right: 1em;"><img border="0" data-original-height="241" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjF7Rt7Q1Cet5Y4Pd_RrJ7mA1qLhUZ6HS6OvYh_T8KUWDV62zW0_-Bu8sSPi6GmZPnAxiqGzKg9z-GJF2JMAebOmbAWrMIECRHCZl_brCLJxPjFf5H-Q7Z4ZKbHqKRX8QWcnMNLGiC0VkI/s16000/PIC_2.jpg" /></a></div><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;">雖然有諸多優點,然而癌症 fusion RNA 基因定序存在許多困難之處,包含:</div><div style="text-align: left;"><br /><b>( 1 ) 樣品條件</b><br />樣品萃取是 NGS 實驗關鍵的第一步,需取得完整度足夠的 RNA 樣品,才可進行有效定序,參考 RNA 樣品品質指標 — DV200 ( RNA > 200nt 的片段比例 ),以預估 RNA 完整性,建議至少使用 DV200 ≥ 30% 之 RNA <a href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/656736v1?__cf_chl_managed_tk__=2c6GzJIrAIAcxXmlp28NjIkGV_k8KCUdvGW9ReFrPqI-1636078594-0-gaNycGzNCOU"><i><b>3</b></i></a>,當樣品品質 / 完整度越高,基因定序結果的可信度越高。</div><div style="text-align: left;"><br /><b>( 2 ) 資料分析</b><br />Fusion gene 變異頻率微弱,增加了突變訊號檢測的困難性,Gene junction 區域 reads 的 coverage ( 覆蓋率 ) 與 abundance ( 表現量 ) 不足會造成 RNA fusion 假陰性結果。ICGC-TCGA DREAM Somatic Mutation Calling in RNA ( SMCRNA ) 計畫利用 RNA-seq 取得大量癌症數據,提供準確預測 RNA fusion 訊息的分析方式,可透過 <a href="https://github.com/SMC-RNA-challenge">https://github.com/SMC-RNA-challenge</a> 來參考分析 <i><b><a href="https://www.cell.com/cell-systems/fulltext/S2405-4712(21)00207-6?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2405471221002076%3Fshowall%3Dtrue">4</a></b></i>。</div><div style="text-align: left;"><br /><b>( 3 ) 建庫方法</b><br />一般研究用的 poly-A RNA Selection 無法用於臨床降解嚴重的 RNA 樣品,並且無法將定序集中在 exon junctions 之上。RNA capture 是一種抓取 RNA CDS exome 技術,其利用探針將重要的目標基因 exons 抓取下來,可獲得更顯著的 RNA fusion / splicing 訊號。<span style="color: red;"><b>美國權威醫學中心 — 梅奧醫院 ( Mayo Clinics ) 為發展個人化醫療</b></span>,使用 Agilent SureSelect 系統 <span style="color: #ffa400;">( Table2. T47D+_Capture )</span> 進行 RNA ( SureSelect All exon+UTR v4 ) 抓取並建庫 <a href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/656736v1?__cf_chl_managed_tk__=P1ZQOIwcNPwL9pfJXLdLOHcYeu5J2SWGMNYHwWjYC50-1636092910-0-gaNycGzNCP0"><i><b>5</b></i></a>,偵測到近 2 倍的 fusion reads <span style="color: #ffa400;">( Table2 )</span>,更可能發現 mRNA 之外,其他上游基因產物 pre-mRNA 或 DNA 的 fusion 情形,找到完整的潛藏變異。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align: center;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEj6cozbnwgWDOGWgOiXdhzviRpC5c9T9PEMCHcHu_1t-ThaewsvEx62Fg5YC1sv_fwmH6tHKofAZtbwjAWUZVFH5dxlo5t7e_fSXEGHBSy23ABLqO_GwzQ8_xfnRApuTIjvuAk78MK9LBE/s800/PIC_3.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="257" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEj6cozbnwgWDOGWgOiXdhzviRpC5c9T9PEMCHcHu_1t-ThaewsvEx62Fg5YC1sv_fwmH6tHKofAZtbwjAWUZVFH5dxlo5t7e_fSXEGHBSy23ABLqO_GwzQ8_xfnRApuTIjvuAk78MK9LBE/s16000/PIC_3.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【Table2】Fusion Supporting Reads for Sample T47D+ with and without All-Exon Capture</td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: right;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhr0vx0xMw9OGnDB5a__UtiNCVBpbZvpl1KzhfzOGSS0Pjo4aYj80gKYSnEv9oVm5okNzItQ2-35ja7TBDkTfpqOQs9R86L8LhvlZlNJb1May8UH7vsOnK_uqdF65398ihvjcOC7qG1RTw/s990/PIC_4.jpg" style="clear: right; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="990" data-original-width="800" height="400" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhr0vx0xMw9OGnDB5a__UtiNCVBpbZvpl1KzhfzOGSS0Pjo4aYj80gKYSnEv9oVm5okNzItQ2-35ja7TBDkTfpqOQs9R86L8LhvlZlNJb1May8UH7vsOnK_uqdF65398ihvjcOC7qG1RTw/w324-h400/PIC_4.jpg" width="324" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【圖二】Kinome-centred RNA <br />sequencing identifies novel gene fusion.</td></tr></tbody></table>2013年,荷蘭的癌症研究單位 ( The Netherland Cancer Institute, NKI ) 成功應用 RNA NGS 搭配特殊基因 panel,偵測導致肺癌的重要 RNA fusion 突變 <i><b><a href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/path.4209">6</a></b></i>。其使用 SureSelect RNA capture 系統,抓取關鍵的癌症變異區域 — Kinome,快速偵測 EML4-ALK gene fusion,更發現新的 RNA fusion 變異 — STRN-ALK <span style="color: #ffa400;">( 圖二 )</span>;偵測單一基因所發生各種突變類型 — translocation <span style="color: #ffa400;">( 圖三A, B )</span> 或點突變 <span style="color: #ffa400;">( 圖三C )</span>,獲得更完整的突變訊息。在已知資料的基礎上,鎖定關鍵的癌症區域,可深入定序到低頻率的變異、也能快速從中篩選合適可納入的肺癌檢測內容,符合臨床經濟的考量。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh-Te_h6Vtq6BSRzS3fM482SiStWpu7pUSA9z1HOtUAVdQK_XqeTK5rpQDinz4Qhn025SesY__ww1fuKetC8sspGAWkrFdJzS2p0FYGktJnEZu5cbImQG-SBzXRRD5bMhjedjtAVpKPj40/s800/PIC_5.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="351" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEh-Te_h6Vtq6BSRzS3fM482SiStWpu7pUSA9z1HOtUAVdQK_XqeTK5rpQDinz4Qhn025SesY__ww1fuKetC8sspGAWkrFdJzS2p0FYGktJnEZu5cbImQG-SBzXRRD5bMhjedjtAVpKPj40/s16000/PIC_5.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【圖三】Multiple mutations identification: FGFR3-TACC3 translocation (A, B) and serine-to-cysteine substitution (C).</td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;">Agilent SureSelect 系統合適癌症 RNA fusion 偵測,歸因於 SureSelect 的:</div><div style="text-align: left;"><br /><b><span style="color: #6aa84f;">1. 基因內容多元設計彈性</span></b><br />包含規格型或客製化方案,如應用現有的 All Exon Target Enrichment 進行全基因掃描,有助快速發現可能的、新的致癌位點;而 Custom Panel 可自由設計最適化內容,對於各癌別基因檢測的研發或臨床更深入的研究,具有高度應用價值。</div><div style="text-align: left;"><br /><span style="color: #6aa84f;"><b>2. 樣品製備方法學最佳化</b></span><br />使用 Probe 抓取法進行 RNA capture 配合 MBC ( Molecular Barcode ) 設計 <span style="color: #ffa400;">( 圖四 )</span>,幫助 transcriptome 分析可以更高的效率獲得豐富、不遺漏的基因訊息,在合適的基因範圍,加強定序深度,在有限資料中發現更多的基因複雜性。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiDgjHvZ2-HmfgUZ1pWReUywljYv3_xB5_8kmiiifDMvc-i1fMZdnLtMKY8ndOxXlitWYuGiO3Zz9HcBNdED7G0c3R3JXkXEHcTi2OW7DJ6hwPulvr1qFAITsiFmMSuQoG8s0pYO6M0vnQ/s800/PIC_6.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="270" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiDgjHvZ2-HmfgUZ1pWReUywljYv3_xB5_8kmiiifDMvc-i1fMZdnLtMKY8ndOxXlitWYuGiO3Zz9HcBNdED7G0c3R3JXkXEHcTi2OW7DJ6hwPulvr1qFAITsiFmMSuQoG8s0pYO6M0vnQ/s16000/PIC_6.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖四】MBC 提升文庫複雜度、減少重複讀取序列</td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><span style="color: #6aa84f;"><b>3. 臨床樣品 ( FFPE ) 最適化</b></span><br />克服高難度的臨床樣品條件,仍保有良好製備品質 ( 高文庫複雜度 ) 與定序效能 ( 低重複序列數據 ),增加臨床研究實用性。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiVOqO7aU-QyGkcHqwPnDYqSP71A3xQM5YKXqtbPmEZNpJeZ6jOdioZuVnKkMMJEX76vQsVUdXBHa3OWUlmLBgT8nVzE1fqe0g6Nzx0UoUUqbyZ-dPm9XbSHkXX6UmRwU4a2OFd8NbqBes/s800/PIC_7.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="251" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiVOqO7aU-QyGkcHqwPnDYqSP71A3xQM5YKXqtbPmEZNpJeZ6jOdioZuVnKkMMJEX76vQsVUdXBHa3OWUlmLBgT8nVzE1fqe0g6Nzx0UoUUqbyZ-dPm9XbSHkXX6UmRwU4a2OFd8NbqBes/s16000/PIC_7.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">【圖五】FFPE-RNA library preparation 最優化</td></tr></tbody></table><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;">NGS 成熟的技術使得「RNA fusion」成為新興的癌症偵測指標,為醫學研究、甚至臨床診斷、預後追蹤、及新的治療策略開發帶來極高的應用價值。2019年,歐洲腫瘤內科學會 ( ESMO ) 整合 gene fusion 檢測的流程 <a href="https://www.annalsofoncology.org/article/S0923-7534(19)45992-9/fulltext"><i><b>7</b></i></a> <span style="color: #ffa400;">( 圖六 )</span>,為了 RNA fusion 檢測能夠再進一步發展,有效應用在癌症診斷,因此將 RNA NGS 作為第一線檢測工具,搭配 IHC 法確認癌變基因,加速臨床作業效率、節省醫療成本,特別是幫助病徵、病因不明確的病人爭取時間,可以盡早對症治療。</div><div style="text-align: left;"><br />RNA NGS 檢測 gene fusion 的優勢在於突破 DNA 提供的遺傳訊息,發現更多細胞真實的基因異常表現狀況,如何影響癌症生成。Cancer genome projects 已進入了成熟期,而 RNA fusion 檢測才剛起步,可以預期 RNA fusion 將為新型癌症檢測的發展重點。</div><div style="text-align: left;"><br /></div><table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><tbody><tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjzTob5_-6Mzw5yOOCdMVx2Iz0z3zkfNr-EfY2xtQb3mpjjGq_q3I2EXVTTJE1_oclzRhB86fuh6ajffAjJ0ND8uNK8DQpv8O_wOhg0SdCgkZGIpQk2aJAxitQEzCNx-op-olJuzClR86E/s800/PIC_8.jpg" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" data-original-height="430" data-original-width="800" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjzTob5_-6Mzw5yOOCdMVx2Iz0z3zkfNr-EfY2xtQb3mpjjGq_q3I2EXVTTJE1_oclzRhB86fuh6ajffAjJ0ND8uNK8DQpv8O_wOhg0SdCgkZGIpQk2aJAxitQEzCNx-op-olJuzClR86E/s16000/PIC_8.jpg" /></a></td></tr><tr><td class="tr-caption" style="text-align: left;">【圖六】ESMO Translational Research and Precision Medicine Working Group recommendations.</td></tr></tbody></table><br /><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><br /></div><div style="text-align: left;"><div style="text-align: left;"><b><span style="color: #ffa400;">【參考資料】</span></b><br />1. <a href="https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.03.050"><span style="color: #444444;">https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.03.050</span></a><br />2. <a href="https://doi.org/10.1093/annonc/mdz204"><span style="color: #444444;">https://doi.org/10.1093/annonc/mdz204</span></a><br />3. <a href="https://doi.org/10.1101/656736"><span style="color: #444444;">https://doi.org/10.1101/656736</span></a><br />4. <a href="https://doi.org/10.1016/j.cels.2021.05.021"><span style="color: #444444;">https://doi.org/10.1016/j.cels.2021.05.021</span></a><br />5. <a href="https://doi.org/10.1002/path.4209"><span style="color: #444444;">https://doi.org/10.1002/path.4209</span></a></div></div></div></div>welgenehttp://www.blogger.com/profile/00342684506307100902noreply@blogger.com0