二級抗體能結合至一級抗體，常用於檢測和純化目標蛋白的分析中，如 ELISA、免疫螢光法 (IF, Immunofluorescence)、西方墨點法 (WB, Western Blot)。二級抗體還可與其它像是螢光染劑或酵素等的小分子結合，使得它們更容易被檢測。使用二次抗體能減少一級抗體額外嵌合分子標記的需求，使得一級抗體能更有效地辨識目標抗原。此外，一級抗體能與嵌合不同分子標記的同種二級抗體作結合，讓檢測更為彈性與強大。EpiGentek 的高品質二級抗體適用各種實驗應用，此外也有多樣的分子標定嵌合種類與抗體類型可供選擇，但在眾多的二級抗體中如何選擇最適合的呢? 只要把握以下要點就不用擔心：
1. 宿主：
宿主是製造抗體的來源物種。二級抗體的生產來源必定是不同於一級抗體的物種來源，由此來增加二級抗體對於一級抗體的辨識特異性。例如一級抗體來自於小鼠 (mouse) 時，二級抗體就必須是抗小鼠 (anti-mouse) 的，或者是原本不會在小鼠中出現的抗體。
2. 檢測方法：
選擇最佳二級抗體另一個重要因素是分析方法。如果目標分析方法是 WB、IP 或者 ELISA，理想的二級抗體是與酵素嵌合的。如果是 IF 或流式細胞儀 (FC, Flow Cytometry) 的實驗，嵌合螢光染劑的二級抗體則是最好的選擇。若是要偵測低表現量的蛋白質，推薦可以選擇嵌合生物素 (biotinylated) 的二級抗體。
3. 純化方式：
抗體的純化經由將其通過具有固定化配體樹脂 (immobilized ligand resin) 的管柱。配體和抗體相互結合後，血清經由清洗步驟並加入試劑來分離配體與抗體的結合作用，進而產生純化的抗體。這類型的純化是以目標抗原 (抗體辨識配體) 或親和性配體 (配體辨識抗體) 的方式進行。目標抗原方式只適合用於純化特定抗原專一性的二級抗體，一般最常用純化二級抗體的方式則是親和性配體方法。親和性純化的抗體可以增加其專一性、降低背景值並提高敏感性。經過純化的抗體能有效減少其差異性，使其獲得更佳的實驗重複性。
4. 交叉吸附 (Cross-adsorption)：
交叉吸附步驟是一種提高二級抗體專一性的方式，將二級抗體經過含不同物種抗體的固定式基質管住，讓這些二級抗體辨識這些外來抗體，並經過辨識結合、沖洗等步驟，這個過程可以減少二級抗體產生來自非目標抗體的交叉反應 (cross-reactivity)，有效增加其二級抗體的專一性。
5. 完整或片段式：
二級抗體可以是完整或片段化的型式，這兩者間的選擇取決於應用方式。完整二級抗體較為普遍並含有H & L chains。它們不但擁有強效的二價結合可變異區，同時也有足夠的區域能結合酵素及染劑，然而，它們卻也導致較高背景值、增加交叉反應性和降低其特異性。片段式的二級抗體分為兩種類型：F(ab)和F(ab')2，此兩類型抗體的尺寸都很小並且能有效去除Fc 受體區造成的非專一性結合，很適合用於 FC、IHC 和 IF 等實驗應用。F(ab) 片段是由 papain 酵素切除完整抗體而產生的小單價抗體片段 (MW =〜50kDa），此片段含有單個結合區域和小的保留區，常用於阻斷 (blocking) 實驗中由一級抗體所造成的背景值及細胞和組織中的內源性免疫球蛋白背景值。F(ab')2 是使用 pepsin 酵素從完整抗體切除所得到的二價抗體片段，除了仍保有強二價鍵結的可變辨識區外，小尺寸結構 (MW =〜110kDa) 使其更容易進入到組織中，然而小尺寸的結構也使得染劑和酵素嵌合的空間更為受限，導致其敏感性降低。
6. Multiplexing：
二級抗體擁有能嵌合多種類螢光染劑的優勢，能於單次實驗中分別針對不同的目標來選擇嵌合不同螢光染劑的二級抗體。適合此應用的抗體首選高度交叉吸附處理的二級抗體，能有效降低物種間的交叉反應和背景值。
7. 分型 (型/亞型)：
抗體有分為 IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE 等 isotype。EpiGentek 提供的 IgG 抗體，共分為 IgG1、IgG2a 和 IgG2b 三種亞型 (G1 和 G2 之間的差異在於胺基酸組成不同）。當選擇二級抗體時，需要選擇能專一辨識特定的一級抗體類型 (型/ 亞型)，如果一級抗體是 IgG，二級抗體就需要是能辨識一級抗體 H＆L Chains 的抗 IgG (anti-IgG) 型抗體。單株 (monoclonal) IgG 抗體擁有亞型的特異性，因此二級抗體需能專一性辨識相同的亞型。但若一級抗體的類型是未知的情況下，就請使用抗 IgG (anti-IgG F (ab) 的二級抗體。
文章參考 Epigentek : How to Select the Right Secondary Antibody.
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