外泌體的一般結構
外泌體的一般特徵為脂質雙層膜包裹多種生物分子，包括蛋白質、RNA，甚至DNA。以下是關鍵組件的概述：1. 脂質雙層：外泌體被脂質雙層膜包圍，類似細胞膜。此雙層含有各種脂質，包括膽固醇、鞘磷脂和磷脂醯絲胺酸，有助於維持外泌體的結構完整性和功能，可能還有其他脂質參與訊號傳導和代謝。
2. 表面蛋白質：外泌體的膜上佈滿了在細胞靶向和攝取中發揮作用的各種蛋白質，包括：
- 四跨膜蛋白：如CD9、CD63、CD81、CD82等，這些蛋白常作鑑定外泌體的標記。
- 組合蛋白(integrin)：參與細胞黏附和訊號傳導。
- MHC 分子：參與抗原呈現和免疫調節的主要組織相容性複合體蛋白。
3. 蛋白質：熱休克蛋白 (HSP，參與蛋白質折疊和抗壓力保護)、酵素、訊號蛋白、細胞骨架蛋白和其他反映供體(donor)細胞來源的蛋白質。
4. 核酸：各種類型的RNA，包括mRNA、微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lincRNA)，有時還有 DNA。這些核酸會影響受體細胞中的基因表現。
5. 代謝物：參與代謝過程的小分子。
外泌體的結構和組成可以根據其來源細胞的生理或病理條件而改變。這種多功能性使外泌體能夠在細胞間通訊和調節中發揮廣泛的功能。
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| 圖一，外泌體的一般結構(取自Jan et al., 2021)[1]。 |
純化外泌體的方法
有多種方法可從生物樣本（例如細胞培養上清液、血液或其他體液）中純化外泌體：第一個步驟是將它們從體液或細胞培養上清液中分離，再接以純化，常見技術包括差速超高速離心、密度梯度離心、粒徑篩析層析法和商業外泌體分離試劑套組，每種方法都有其優點和限制：1. 差速超高速離心：
這是應用最廣泛的方法。以逐步增快的速度連續進行離心步驟，以去除細胞、碎片和較
大的囊泡，然後進行超高速離心以沉澱外泌體。
優點：簡單、成本低。
缺點：耗時且可能一併純化到其他細胞外囊泡和蛋白質聚合體。
2. 密度梯度離心：
使用密度梯度（例如蔗糖或碘克沙醇）基於外泌體的浮力密度(buoyant density)以分離
缺點：耗時且可能一併純化到其他細胞外囊泡和蛋白質聚合體。
2. 密度梯度離心：
使用密度梯度（例如蔗糖或碘克沙醇）基於外泌體的浮力密度(buoyant density)以分離
外泌體。
優點：與差速超高速離心相比純度更高。
缺點：更複雜，需要更多時間和專業設備。
3. 粒徑篩析層析法 (Size Exclusion Chromatography ，SEC)：
當外泌體通過多孔基質的層析管柱時，根據顆粒大小進行分離。
優點：對外泌體溫和，保持其完整性。
缺點：可能需要進一步的純化步驟以提高純度。
4. 免疫親和捕獲：
使用針對外泌體表面特異性分子（例如 CD9、CD63、CD81）的抗體來捕獲外泌體。
優點：針對外泌體進行純化，特異性高。
缺點：價格昂貴並且產量較低。
5. 沉澱法：
利用聚乙二醇 (PEG) 等聚合物從溶液中沉澱外泌體。
優點：簡單、快速。
缺點：污染物共沉澱，純度較低。
6. 微流體分離法：
微流體裝置設計可以根據分子大小、免疫親和或其他特性分離外泌體。
優點：精度高，具有高通量處理的潛力。
缺點：需要專門的設備和專業知識。
研究人員可以根據應用的特定要求（例如純度、產量和生物樣品的類型）來選擇每種方法，或考慮使用多種方法的組合來達到外泌體純化的最佳結果。
定量和品質評估：RNA萃取後，使用分光光度計或螢光法定量RNA濃度及純度。此外，通常一併微流體電泳（例如Bioanalyzer）等儀器評估RNA的長度及品質。
1. 外泌體形成過程選擇性包裝小分子RNA，如 microRNA(miRNA)、轉移RNA(tRNA) 片段和其他調節RNA，而18S 和 28S rRNA是大分子（分別約 1.9 kb 和 5 kb）。外泌體生成和裝載所涉及的機制可能會優先排除此類大的RNA分子，從而有利於包含較小的RNA種類。
2. 功能作用：外泌體中發現的RNA種類通常在受體細胞中具有調節作用，例如)基因表現調節，而不是通常與 rRNA相關的結構和蛋白質合成功能。在分析外泌體RNA時，研究人員經常發現其RNA譜與細胞總RNA者有顯著不同，其中 18S 和 28S rRNA的存在顯著減少。這通常透過RNA品質評估方法來確認，例如於2017年Tang 等研究人員[2]分析細胞株培養上清液的外泌體RNA即發現外泌體RNA的18S 和 28S rRNA顯著減少、小分子RNA含量較高(圖二)。
以下是外泌體中RNA類型的概述：
1. 微小RNA（miRNA）：
miRNA是外泌體中最豐富的RNA類型之一，透過靶向mRNA進行降解或抑制轉譯，在
2. mRNA：
供體細胞可以將mRNA轉移到受體細胞，轉譯生產蛋白質以執行其功能，這些mRNA在
3. lincRNA：
外泌體中的lincRNA可以在多個層面上調節基因表現，包括染色質修飾、轉錄和轉錄後
5. tRNA（轉移RNA）：
外泌體中 tRNA可以發揮調節作用，包括壓力反應的調節和細胞間訊號傳導。
6. 小核RNA(snRNA) 和小核仁RNA(snoRNA)：
snRNA參與RNA剪接，而 snoRNA則參與導引其他RNA的化學修飾。這些RNA參與受
7. Piwi interacting RNA(piRNA)：
外泌體中的piRNA參與RNA silence，而調節基因表現。
1. 外泌體大小評估：純化過程後，需要評估分離的外泌體的純度。這可以使用奈米顆粒追蹤分析 (Nanoparticle Tracking Analysis ，NTA)、穿透式電子顯微鏡 (Transmission Electron microscopy，TEM) 或流式細胞儀等技術來完成。這些方法有助於確定外泌體的尺寸分佈和濃度，並識別是否有其他污染囊泡。
2. 特定蛋白質含量分析：外泌體富含各種蛋白質，包括特定標記蛋白，如 CD63、CD81 和 CD9。可以採用ELISA、西方墨點或抗體辨識後結合流式細胞儀等蛋白質分析技術來確認這些標記的存在，從而進一步驗證分離的外泌體。
3. RNAQC：如前所述，外泌體還含有小分子RNA，包括 microRNA及lincRNA等。其RNAQC在科學文獻中多採用Agilent Bioanalyzer或 TapeStation進行分析，通常完整的分析流程分兩步驟：
步驟一，以電泳分析確認純化得到的外泌體RNA並無細胞RNA的汙染：常用的電泳分析儀如Agilent Bioanalyzer或Agilent TapeStation，搭配其一般解析度的電泳試劑進行分析；外泌體RNA電泳譜通常缺少18S 和 28S rRNA相對應的明顯峰值(圖四，紅色虛線框起處)，而小分子RNA的波峰在20-150 nt之間(圖四，藍色虛線框起處)。
步驟二，以小分子電泳分析確認外泌體RNA的長度：常用的電泳分析儀如Agilent Bioanalyzer，搭配small RNA assay電泳試劑進行分析；small RNA assay的電泳膠體配方可以提高小分子RNA的解析度(圖五A)，以進行定量及RNA分子長度分析(圖五B)。
- 分子數據：包含來自不同物種、組織和細胞類型的外泌體等胞外囊泡的蛋白質組、轉
[1] Jan et al., Expedition into Exosome Biology: A Perspective of Progress from Discovery to Therapeutic Development. Cancers, 2021 Mar; 13(5): 1157.
[2] Taylor et al., Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling Article in Methods in molecular biology. 2011. February
[3] Ng et al., Functional role of circular RNAs in cancer development and progression. RNA Biology, 2018; 15(8): 995–1005.
[4] Analysis of miRNA content in total RNA preparations using the Agilent 2100 bioanalyzer. Application Note Published February 1, 2008. Agilent Technologies. Publication Number 5989-7870EN.
[5] QIAseq® miRNA Library Kit Handbook. Precision small RNA library prep for Thermo Fisher Scientific® NGS systems. QIAGEN. September 2023
[6] Chitti et al., Vesiclepedia 2024: an extracellular vesicles and extracellular particles repository. Nucleic Acids Res. 2024 Jan 5;52(D1):D1694-D1698.
優點：與差速超高速離心相比純度更高。
缺點：更複雜，需要更多時間和專業設備。
3. 粒徑篩析層析法 (Size Exclusion Chromatography ，SEC)：
當外泌體通過多孔基質的層析管柱時，根據顆粒大小進行分離。
優點：對外泌體溫和，保持其完整性。
缺點：可能需要進一步的純化步驟以提高純度。
4. 免疫親和捕獲：
使用針對外泌體表面特異性分子（例如 CD9、CD63、CD81）的抗體來捕獲外泌體。
優點：針對外泌體進行純化，特異性高。
缺點：價格昂貴並且產量較低。
5. 沉澱法：
利用聚乙二醇 (PEG) 等聚合物從溶液中沉澱外泌體。
優點：簡單、快速。
缺點：污染物共沉澱，純度較低。
6. 微流體分離法：
微流體裝置設計可以根據分子大小、免疫親和或其他特性分離外泌體。
優點：精度高，具有高通量處理的潛力。
缺點：需要專門的設備和專業知識。
研究人員可以根據應用的特定要求（例如純度、產量和生物樣品的類型）來選擇每種方法，或考慮使用多種方法的組合來達到外泌體純化的最佳結果。
從外泌體中純化RNA：
一旦分離出外泌體，就可以從中純化RNA。目前已經有市售的純化RNA試劑組針對從外泌體分離RNA。這些試劑套組通常涉及溶解外泌體的脂膜以釋放RNA，然後使用苯酚氯仿萃取或管柱純化等方法純化RNA。定量和品質評估：RNA萃取後，使用分光光度計或螢光法定量RNA濃度及純度。此外，通常一併微流體電泳（例如Bioanalyzer）等儀器評估RNA的長度及品質。
外泌體RNA是否含有18S和28S rRNA？
外泌體RNA通常含非常低量或不含18S和28S核醣體RNA(rRNA)。這些 rRNA在細胞中含量豐富，但在外泌體中並不常見。外泌體18S和28S rRNA含量低的原因可能為：1. 外泌體形成過程選擇性包裝小分子RNA，如 microRNA(miRNA)、轉移RNA(tRNA) 片段和其他調節RNA，而18S 和 28S rRNA是大分子（分別約 1.9 kb 和 5 kb）。外泌體生成和裝載所涉及的機制可能會優先排除此類大的RNA分子，從而有利於包含較小的RNA種類。
2. 功能作用：外泌體中發現的RNA種類通常在受體細胞中具有調節作用，例如)基因表現調節，而不是通常與 rRNA相關的結構和蛋白質合成功能。在分析外泌體RNA時，研究人員經常發現其RNA譜與細胞總RNA者有顯著不同，其中 18S 和 28S rRNA的存在顯著減少。這通常透過RNA品質評估方法來確認，例如於2017年Tang 等研究人員[2]分析細胞株培養上清液的外泌體RNA即發現外泌體RNA的18S 和 28S rRNA顯著減少、小分子RNA含量較高(圖二)。
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| 圖二，左圖Tang 等研究人員2以超高速離心法、或商用沉澱法試劑套組純化細胞培養上清液的外泌體、再接以四種市售的純化RNA試劑組純化其中RNA，發現在各種不同組合方法所得的外泌體RNA，其18S 和 28S rRNA皆顯著減少、小分子RNA含量較高。 |
外泌體所含的RNA類型有哪些？
外泌體RNA的種類可能因細胞類型、供體細胞的生理或病理狀態以及外泌體分離和RNA萃取方法而異。這種多樣性和特異性使外泌體RNA成為多種疾病生物標記，包括癌症、神經退化性疾病和傳染病。此外，外泌體RNA也正在研發其應用於治療應用，因為它可以調節受體細胞中的基因表現和細胞功能。以下是外泌體中RNA類型的概述：
1. 微小RNA（miRNA）：
miRNA是外泌體中最豐富的RNA類型之一，透過靶向mRNA進行降解或抑制轉譯，在
調節受體細胞功能中發揮關鍵作用，這些miRNA在許多疾病已被開發作為生物標記。
2. mRNA：
供體細胞可以將mRNA轉移到受體細胞，轉譯生產蛋白質以執行其功能，這些mRNA在
許多疾病也被開發作為生物標記。
3. lincRNA：
外泌體中的lincRNA可以在多個層面上調節基因表現，包括染色質修飾、轉錄和轉錄後
加工。
4. 環狀RNA(circRNA)：
外泌體中的 circRNA可以充當 miRNA停靠站[3] (圖三)，間接影響 miRNA活性和調節
4. 環狀RNA(circRNA)：
外泌體中的 circRNA可以充當 miRNA停靠站[3] (圖三)，間接影響 miRNA活性和調節
基因表現。
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| 圖三，外泌體中的 circRNA可以充當 miRNA停靠站(或稱為miRNA海綿，miRNAsponge)，間接影響 miRNA活性和調節基因表現(Ng et al., 2018) |
5. tRNA（轉移RNA）：
外泌體中 tRNA可以發揮調節作用，包括壓力反應的調節和細胞間訊號傳導。
6. 小核RNA(snRNA) 和小核仁RNA(snoRNA)：
snRNA參與RNA剪接，而 snoRNA則參與導引其他RNA的化學修飾。這些RNA參與受
體細胞相關基因的調節過程。
7. Piwi interacting RNA(piRNA)：
外泌體中的piRNA參與RNA silence，而調節基因表現。
外泌體純化過程的品質管制
外泌體純化是外泌體研究和生物技術應用的關鍵過程。品質管制確保純化的外泌體在純度、產量和功能方面符合所需標準。以下是外泌體純化的品質管制流程的概述：1. 外泌體大小評估：純化過程後，需要評估分離的外泌體的純度。這可以使用奈米顆粒追蹤分析 (Nanoparticle Tracking Analysis ，NTA)、穿透式電子顯微鏡 (Transmission Electron microscopy，TEM) 或流式細胞儀等技術來完成。這些方法有助於確定外泌體的尺寸分佈和濃度，並識別是否有其他污染囊泡。
2. 特定蛋白質含量分析：外泌體富含各種蛋白質，包括特定標記蛋白，如 CD63、CD81 和 CD9。可以採用ELISA、西方墨點或抗體辨識後結合流式細胞儀等蛋白質分析技術來確認這些標記的存在，從而進一步驗證分離的外泌體。
3. RNAQC：如前所述，外泌體還含有小分子RNA，包括 microRNA及lincRNA等。其RNAQC在科學文獻中多採用Agilent Bioanalyzer或 TapeStation進行分析，通常完整的分析流程分兩步驟：
步驟一，以電泳分析確認純化得到的外泌體RNA並無細胞RNA的汙染：常用的電泳分析儀如Agilent Bioanalyzer或Agilent TapeStation，搭配其一般解析度的電泳試劑進行分析；外泌體RNA電泳譜通常缺少18S 和 28S rRNA相對應的明顯峰值(圖四，紅色虛線框起處)，而小分子RNA的波峰在20-150 nt之間(圖四，藍色虛線框起處)。
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| 圖四，外泌體RNA以Agilent Bioanalyzer 2100的RNA6000 assay電泳分析，通常外泌體RNA缺少18S 和 28S rRNA(紅色虛線框起處)，而小分子RNA的波峰在20-150 nt之間(藍色虛線框起處)。 |
步驟二，以小分子電泳分析確認外泌體RNA的長度：常用的電泳分析儀如Agilent Bioanalyzer，搭配small RNA assay電泳試劑進行分析；small RNA assay的電泳膠體配方可以提高小分子RNA的解析度(圖五A)，以進行定量及RNA分子長度分析(圖五B)。
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| 圖五，以Agilent Bioanalyzer 2100 的small RNA assay進行於分析及定量小分子RNA（長度範圍為6至150個核苷酸）。 左側A圖，small RNA assay分析一般細胞所含的小分子RNA的電泳結果，幾個主要的波峰如microRNA(miRNA)、tRNA和small rRNA。miRNA的長度通常為 18 至 24 個核苷酸、tRNA為70至100個核苷酸、5S rRNA則為~120個核苷酸。Bioanalyzer 的分析軟體可以藉由隨同電泳分析的RNA標準品進行螢光亮度比對而推算樣品中RNA濃度；將miRNA長度範圍的波峰面積除以總面積範圍（通常為 6-150 個核苷酸），即得 miRNA%，RNA總濃度X miRNA%即等於miRNA濃度(取自Agilent Technologies應用註釋文件5989-7870EN)[4]。 右側B圖，small RNA assay分析外泌體RNA的電泳結果，外泌體RNA濃度推算得538.7 pg/ul，計算miRNA占比為62%，計算miRNA濃度為331.8 pg/ul。 |
4. 內毒素檢測：如果外泌體用於治療應用，那麼檢測內毒素污染至關重要。內毒素通常來自細菌，可以引起強烈的免疫反應，必須盡量減少或消除。可使用鱟變形細胞溶解液 (Limulus Amebocyte Lysate，LAL)，利用其與內毒素反應會產生凝集的特性而發展出來偵測內毒素。
外泌體RNA定序
近年來，NGS 已成為一種高通量的研究工具，應用於分析RNA表現分析和發現新的RNA分子，因此適用於外泌體RNA分析。如前所述，外泌體形成過程選擇性包裝小分子RNA，如 miRNA、lincRNA等，這些小分子RNA大多缺少polyA tail、或3' 端有羥基化、或5' 端有磷酸化修飾，這些特性使一般針對mRNA的NGS文庫試劑無法順利建庫，因此，現在已經有商用套組針對miRNA這類的小分子RNA設計配套的NGS文庫試劑，使得外泌體RNA得以順利分析(圖六)。
圖六，miRNA建庫原理，在建庫反應中，帶有polyA 序列的adaptor先連接至 miRNA 的 3'端，再解以另一RNA adaptor連接至5'端，隨後進行雙股 cDNA 合成、cDNA 清理、文庫擴增。（取自QIAseq miRNA Library Kit Handbook）[5]：
外泌體生物分子資料庫
澳洲的學術單位分別成立了ExoCarta (http://www.exocarta.org/)及Vesiclepedia (http://www.microvesicles.org/) 兩個資料庫，匯集了外泌體(ExoCarta)或細胞外囊泡 (Vesiclepedia)的訊息，其中包括外泌體、微泡和其他類型的囊泡。這兩個資料庫都是一個社群註釋資料庫，提供有關各種生物來源的外泌體或細胞外囊泡分子組成的數據(圖七)。
圖七，Vesiclepedia及ExoCarta 是一個對細胞外囊泡 (Vesiclepedia)及外泌體所包含的蛋白質、RNA和脂質進行分類的資料庫。細胞外囊泡包含外泌體等是大多數細胞類型（包括癌細胞）分泌到細胞外環境的小囊泡這兩個資料庫彙編了有關外泌體組成的各種研究的數據，為研究人員提供了有關其內容的有價值的資訊。此資料庫可用於研究外泌體在正常生理過程以及癌症等疾病中的作用。(取自Chitti et al., 2024)[6]
1. 資料庫主要特徵
- 分子數據：包含來自不同物種、組織和細胞類型的外泌體等胞外囊泡的蛋白質組、轉
錄組和脂質組譜的大量數據。
- 搜尋功能：允許使用者搜尋與外泌體等胞外囊泡相關的特定蛋白質、RNA或脂質，以
及有關其生物來源和實驗條件的資訊。
- 註解和管理：資料庫中的數據由研究界註釋和管理，確保資訊高品質和可靠。
- 可下載資料集：使用者可以下載資料集以進行進一步分析並與自己的研究結合。
2. 資料類型
- 蛋白質：有關 外泌體等胞外囊泡中識別的蛋白質的資訊，包括其含量和潛在功能。
- RNA：外泌體等胞外囊泡中發現的各種類型RNA的數據，例如mRNA、miRNA和其
- 可下載資料集：使用者可以下載資料集以進行進一步分析並與自己的研究結合。
2. 資料類型
- 蛋白質：有關 外泌體等胞外囊泡中識別的蛋白質的資訊，包括其含量和潛在功能。
- RNA：外泌體等胞外囊泡中發現的各種類型RNA的數據，例如mRNA、miRNA和其
他非編碼RNA。
- 脂質：外泌體等胞外囊泡的膜中存在的脂質概況及其在胞外囊泡的功能和穩定性中的潛
- 脂質：外泌體等胞外囊泡的膜中存在的脂質概況及其在胞外囊泡的功能和穩定性中的潛
在角色。
- 代謝物：有關與外泌體等胞外囊泡相關的代謝物的信息，有助於了解其代謝作用。
3. 應用領域
- 生物標記發現：根據外泌體等胞外囊泡的分子含量幫助識別疾病的潛在生物標記。
- 治療開發：深入了解電動車的治療潛力，包括它們在藥物傳輸和再生醫學的應用。
- 功能研究：支持胞外囊泡生物學功能的研究，包括細胞間通訊和訊號傳導。
- 比較分析：可以對不同來源、條件和疾病狀態的胞外囊泡進行比較。
總體而言，外泌體 RNA 的分析對於增進我們對疾病機制的理解、提高診斷和預後能力、開發新的治療策略以及實現個人化醫療方法非常重要。隨著該領域研究的不斷發展，它為提高多種疾病的醫療保健效果帶來了巨大的希望
- 代謝物：有關與外泌體等胞外囊泡相關的代謝物的信息，有助於了解其代謝作用。
3. 應用領域
- 生物標記發現：根據外泌體等胞外囊泡的分子含量幫助識別疾病的潛在生物標記。
- 治療開發：深入了解電動車的治療潛力，包括它們在藥物傳輸和再生醫學的應用。
- 功能研究：支持胞外囊泡生物學功能的研究，包括細胞間通訊和訊號傳導。
- 比較分析：可以對不同來源、條件和疾病狀態的胞外囊泡進行比較。
總體而言，外泌體 RNA 的分析對於增進我們對疾病機制的理解、提高診斷和預後能力、開發新的治療策略以及實現個人化醫療方法非常重要。隨著該領域研究的不斷發展，它為提高多種疾病的醫療保健效果帶來了巨大的希望
[1] Jan et al., Expedition into Exosome Biology: A Perspective of Progress from Discovery to Therapeutic Development. Cancers, 2021 Mar; 13(5): 1157.
[2] Taylor et al., Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling Article in Methods in molecular biology. 2011. February
[3] Ng et al., Functional role of circular RNAs in cancer development and progression. RNA Biology, 2018; 15(8): 995–1005.
[4] Analysis of miRNA content in total RNA preparations using the Agilent 2100 bioanalyzer. Application Note Published February 1, 2008. Agilent Technologies. Publication Number 5989-7870EN.
[5] QIAseq® miRNA Library Kit Handbook. Precision small RNA library prep for Thermo Fisher Scientific® NGS systems. QIAGEN. September 2023
[6] Chitti et al., Vesiclepedia 2024: an extracellular vesicles and extracellular particles repository. Nucleic Acids Res. 2024 Jan 5;52(D1):D1694-D1698.
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