[NGS]不同定序規格對於NGS定序結果的影響

NGS實驗的定序規格該如何選擇？如何在價格及效果的選擇上獲得一個最佳的平衡點？這兩個問題確實相當重要也常有客戶詢問，但這之前我們應先了解定序規格不同對於NGS的結果會造成甚麼樣的差異。威健生技透過RNA-seq內部測試結果，並搭配其他文獻，獨家完整揭露定序讀長、定序量、Single End與Paired-End對NGS結果之影響，這是目前全台灣業界第一也是唯一的真實實驗數據與比較！

首先針對定序量來看，先前在NGS的基本概念一文中曾提到，NGS實驗就好比抽籤的機率問題，我們永遠無法得知實驗樣品裡面的真實狀態(複雜度)，僅能靠著經驗或其他實驗工具做初步的推估與猜測，因此複雜度越高，定序量就必須越高，就好比增加抽籤次數，越能看出整個樣品的原始樣貌，反之亦然。現今NGS黃金準則大家的共識仍就是「越高(多)越好」，事實上從許多文獻都可以看出一些端倪，去年5月發表在GENOME RESEARCH就有一篇文章曾提到(Genome Res. 2011 Jun;21(6):991-8)，作者以Human B-cell利用Solexa平台進行RNA-seq的實驗，將20個樣品RNA-seq的結果累加， Pool Data獲得總定序量大約在900 million reads (50PE)，依此當做每個基因及Transcripts的最終基因表現值(Final FPKM)，實驗結果有三大發現，第一，當定序量超過100 million reads時，能比對回Reference Human Genome的比例大約維持在80%左右；第二，定序量在100 million reads與Final FPKM的差距在±5%的基因數僅有6%，但定序量提升到500 million reads，與Final FPKM的差距在±5%的基因數則提升到72%；第三，40 million reads雖然對於基因Alternative Splicing的偵測敏感性不佳，但對於偵測到大部分已知基因的表現卻已足夠。從上述三點結論我們可以知道，進行Resequencing的實驗判斷一個定序結果的好壞從Mappable Rate的粗略估計，60-65%以上的Mappability都是可以接受的，75-90%則是一個相當不錯的定序結果；定序量多寡確實也影響著偵測基因數與表現量。因此我們可以知道定序量對於NGS實驗結果的影響層面至少包含比對率及偵側能力！

再來看到威健生技內部RNA-seq測試結果，我們以Reads數做為定序量的標準，探討在相同定序量不同定序規格(Single End & Paired-End)及讀長(36bp/50bp/75bp/90bp)對於Mappability之影響，從下圖可以清楚看到，讀長越長能比對回Reference Genome的Reads會越多，這主要牽扯到Mapping的過程中Reads的特異性(Specificity)，在比對分析我們會把過多重複比對上Genome不同位置的Reads移除 (Multiple Mapping)，而無法確認該Reads真實的位置，後序分析會造成一定的誤差，因此讀長越長能提高該Read在Reference Genome的位置，所以36bp的Mappability很明顯較低，讀長一但超過50bp比對率則無明顯差異，有趣的是SE的比對率竟略高於PE，原因是這是在Mapping過程我們故意把去除Multiple Mapping的參數設定相同，這代表著SE比對回Genome的錯誤率也會稍微高一些，但無論SE或PE，讀長50bp以上都可以獲得較佳的比對率。

  

進一步我們來看讀長改變對偵測能力與正確率的差異，從下圖可明顯看不同讀長使用SE的規格所偵測到基因個數差異較大(讀長越短偽陽性比例越高)，而使用PE規格就算讀長改變對於基因個數的影響就如此明顯，從結果我們可以知道PE有一定程度彌補讀長較短的能力，但仔細看X軸的級距其實僅在5%，因此對於偵測能力並無顯著影響。

  

NGS的特色之一就是可以進行沒有Reference Genome的組裝，而我們從下圖以RNA-seq的Novel Transcripts Prediction結果來看，讀長大於50bp所預測的基因總數較36bp來的少，PE亦少於SE，這是因為長度越長，所能Overlapping的部分越多，組裝的效果自然更佳，而PE如同Mapping的原理能依據相對位置準確判定該序列的先後順序，因此分析結果偽陽性也會較低。

    

最後探討相同讀長的狀態下不同定序量所偵測到的基因個數，75PE分別在10、20、30、40 million reads所偵測到基因個數明顯持續上升。

因此從威健生技測試結果我們可以獲得幾個結論：(1)50bp以上已可獲得良好而穩定的比對率。(2)讀長及SE、PE對於偵測能力並無顯著差異，但PE相對於SE可有一定能力可彌補短讀長造成偽陽性的影響。(3)組裝能力PE略優於SE，可有效降低偽陽性，50bp以上讀長更明顯優於36bp。(4)定序量越高樣品實際樣貌的能見度越好。

事實上基於應用、成本、經費考量，NGS仍有基本的建議最低定序量及規格，之後的文章威健生技將以更全面而客觀的角度逐一剖析NGS在各種應用定序規格的選擇概念，提供給客戶最符合實驗需求的建議！

 ~Coming Soon~ 2012 June, Welgene Taiwan Local NGS Service!