[試劑耗材]這就是點突變 (Site-Directed Mutagenesis) - 點突變實驗原理

  


點突變實驗原理

點突變 (site-directed mutagenesis) 的方法有很多種,

發展至今, 除了非指向性的化學突變及放射突變以外,

PCR方式的點突變也有著許多不同的實驗方法及步驟,





市面上許多廠牌都提供各種不同方式的試劑套組,

除了良好品質控管能使實驗能更加順利以外,

創新獨特的實驗流程, 也使得實驗的效率大為提升,



而今最為大家所知, 同時也最多文獻引用的,

是由 Stratagene 發展出來的 QuikChange 系列點突變產品,

經由 dsDNA 的點突變方式, 讓 PCR 更穩定及快速,



以下即簡單介紹,

在點突變界稱得上是 Gold Standard 的 QuikChange 實驗原理,



Mutagenesis Primer :

設計完全互補的一對primer, 其中把想要突變的位點盡量放於primer中間,

primer長度約 25-45 bases, Tm控制在75度以上,

primer兩端最好有G或C加強和template的結合能力。



原本的 vector 因為是由細菌複製, 所以會帶有甲基修飾,

反觀 PCR 產生的 vector 則不會有此修飾產生,



經過 PCR 的複製, 最後會產生帶有完整突變的 dsDNA 以及沒有突變的vector,

利用 Dpn1 辨識甲基位置的特性, 能將原始的 vector 切除,



最後將帶有 gap 的 mutation vector 選殖到勝任細胞中,

細胞會自行修補這些 gap, 形成完整的 dsDNA vector




簡而言之, 點突變的三步驟流程 :

點突變 PCR -> Dpn1去除突變外vector ->選殖到勝任細胞中 (完成!)

只要把握這個原理, 就能輕鬆完成點突變!

QuikChange 系列產品



ps. 想設計點突變的 primer 也不用擔心,

      online 設計 primer, 簡單快速又準確!!

      教學於此 ~  QuikChange Primer Design 使用教學