Cloning 小歷史 - 得來不易的跨國合作成果

張貼者： 日期：
幾十年來分子生物學的基因選殖技術 (Gene Cloning)，從早期分離及組裝單一 DNA 片段都很困難的研究處境，到近年能在短時間內同時進行 10 個 DNA 片段無縫接合的技術，亦或者直接進行 in silico 的全基因載體合成，其技術的爆發性演進帶給各研究學者無限的創造力，也促使各種疾病探索與基因治療等研究能快速發展。然而您知道基因選殖的歷史最早可追朔至 40 多年前，並且是從許多科學家發現的重要元素共同拼湊組成，包含 Cutting (Digestion)、Assembling (Ligation)、Transformation 等，最後才造就出現如今簡單方便的選殖技術。

裂解作用 Cutting (Digestion)

雖然早在 1952 年就發現細菌擁有 “restriction factor” 的物質來抵禦外來細菌噬菌體 (bacteriophages)1, 2，然而直到 1968 年才由 Werner Arber3 順利將此物質 (也就是限制酶) 分離純化出來，透過研究得知此物質不但能切斷此細菌本身以外的外源 DNA，同時也進一步發現細菌內甲基酶 (methylase) 的修飾之下能保護細菌本身免於限制酶的作用，並以此提出假說。1970 年 Hamilton Smith4 則透過從流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenza) 分離的限制酶來更進一步發現限制酶的作用機制，限制酶能選擇性辨識特定 DNA 序列並進行裂解作用，同時此研究也輔證先前 Werner Arber 的假說。一年後，此限制酶的發現正式用於實驗研究，Daniel Nathans5 使用 Smith 發現的限制酶來裂解 5,000 base-pair 的 SV40 病毒，獲得 11 個不同長短的 DNA 片段，Nathans 的實驗室接著又進行多種的限制酶裂解實驗，分別可以獲得各種不同的片段組合，透過這些不同大小片段的組合可以來推測 SV40 病毒的基因組圖譜 (genome map)，這也是早期基因組定序的開始。這些突破性的貢獻也讓 Werner Arber、Hamilton Smith 及 Daniel Nathans 同時獲得 1978 年的諾貝爾生理學或醫學獎。

Werner Arber

組合作用 Assembling (Ligation)

不同於限制酶的 DNA 裂解發現，DNA 的黏合 (join) 發現於更早之前，1960 年間兩個研究團隊6, 7從線性的細菌噬菌體 DNA 能在感染宿主以後快速地黏合成環狀 DNA 的過程中，找到此兩端 DNA 分子黏合的酵素，而就在兩年後，五個研究團隊分別獨立分離出 DNA 接合酶 (ligase) 並證明其 DNA 片段的黏合能力。

選殖作用 Cloning

由於限制酶 (restriction enzyme) 與接合酶 (ligase) 的發現，1972 年 Paul Berg8 嘗試將噬菌體 DNA 及 E. coli galactose operon 與 SV40 DNA 重組黏合，此為歷史上第一個重組 DNA 分子，也開創了各物種的 DNA 可以重組再一起的新思維，這些核酸研究貢獻也讓 Paul Berg 於 1980 年與 Walter Gilbert、Frederick Sanger  共同獲得諾貝爾獎的殊榮。

Paul Berg

細胞轉殖Transformation

一直以來，各個細菌研究室都認為 E. coli 這個常用的菌種是非常不容易進行轉殖實驗 (transformation)，直到1970年 Mandel 和 Higa 發展出 calcium chloride 的化學處理步驟9，可以讓 E. coli 有效吸取外來的 bacteriophage DNA 開始，才開始讓轉殖技術逐步成熟，1973 年，Cohen 和 Boyer10 利用 digestion、ligation 及 transformation 等技術，將 plasmid pSC101 經過 EcoRI 限制酶作用，並利用接合酶黏合至另一段限制酶處理過的 plasmid 片段，將之轉殖到 E. coli 中，來讓此菌帶有 tetracycline 的抗藥能力，這是歷史上第一個重組 DNA 生物體，也是現今選殖實驗的最早雛形。


PCR 的發明帶動選殖技術的成長

隨著 1983 年 Kary Mullis11 發明聚合酶連鎖反應 (PCR) 技術後，除了是現今生物化學及分子生物學不可或缺的關鍵技術以外，也讓當時選殖實驗常遇到沒有足夠 insert DNA 的問題獲得了解決，爾後，各種 PCR cloning 的技術接著被發展出來，例如現在很常見的 TA Cloning 技術就是其中之一。直到 2000年間，DNA assembly 的技術逐漸成熟，越來越多不需要仰賴限制酶而且可以同時進行多片段組合的選殖技術逐漸嶄露頭角，如 2007 年Mamie Z Liz 發明的 SLIC (Sequence and Ligase Independent Cloning)12、2009年 Daniel G Gibson 發明並以自身命名的 Gibson DNA assembly13 技術，以及同樣於 2009 年由 Jiayuan Quan 發展出來的 CPEC (circular polymerase extension cloning)14 等。

時而至今，無論是單片段最基本的 RE cloning (限制酶切接方式)、TA cloning 及近年來推出的 topoisomerase I cloning 高速高效能選殖技術，或者是多片段 DNA 同時進行結合的 Gibson assembly及安捷倫 SureVector 無縫式自選組裝式技術等，都帶給現今的科學家相對過去數年間更為方便且強大的研究方式，隨著各種實驗障礙逐步被克服，或許未來發展的限制就僅在於研究人員的想像力與創造力了吧。


參考文獻
  1. Bertani, G. and Weigle, J.J. (1953) J. Bacteriol. 65, 113–121.
  2. Luria, S.E. and Human, M.L. (1952) J. Bacteriol. 64, 557–569.
  3. Linn, S.  and Arber, W. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59, 1300–1306.
  4. Smith, H.O. and Wilcox, K.W. (1970) J. Mol. Biol. 51, 379–391.
  5. Danna, K. and Nathans, D. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2913–2917.
  6. Kellenberger, G., Zichichi, M.L. and Weigle, J.J. (1961) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 47, 869–878.
  7. Meselson, M. and Weigle, J.J. (1961) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 47, 857–868.
  8. Jackson, D.A., Symons, R.H. and Berg, P. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1972, 69, 2904–2909.
  9. Mandel, M. and Higa, A. (1970) J. Mol. Biol. 1970, 53:159–162.
  10. Cohen, S.N., Chang, A.C., Boyer, H.W. and Helling, R.B. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 3240–3244.
  11. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987;155:335-50.
  12. Li MZ, Elledge SJ. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nat Methods. 2007 Mar;4(3):251-6. Epub 2007 Feb 11.
  13. Daniel G Gibson, Lei Young, Ray-Yuan Chuang, J Craig Venter, Clyde A Hutchison III & Hamilton O Smith. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods 6, 343 - 345 (2009).
  14. Jiayuan Quan, Jingdong Tian. Circular Polymerase Extension Cloning of Complex Gene Libraries and Pathways. PLOS ONE. July 30, 2009.
  15. j5 DNA Assembly
    https://j5.jbei.org/j5manual/pages/22.html
  16. Foundations of Molecular Cloning - Past, Present and Future
    https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/foundations-of-molecular-cloning-past-present-and-future
  17. Scitable : Restriction Enzymes
    http://www.nature.com/scitable/spotlight/restriction-enzymes-18458113
  18. Molecular cloning--Laboratory manuals 3rd

留言

張貼留言