NGS 臨床樣品系列報導 - 6 < cfDNA 番外篇 >

cell free DNA ( cfDNA ) 是存在於循環血液中高度片段化的 DNA，來自凋亡或壞死的細胞，其 DNA 經分解釋放到血液中，另一可能來源則被認為是細胞主動分泌至血液。

cfDNA 種類主要包括：

( 1 ) cell-free fetal DNA ( cffDNA )：在母體血液中循環的胎兒 DNA，靜脈穿刺抽取孕婦血液進行 cffDNA 分析是一種無創性產前檢測方法，可應用於臨床篩檢胎兒的某些遺傳基因變異。

( 2 ) circulating tumor DNA ( ctDNA )：癌細胞所釋放的游離 DNA，研究也證實 ctDNA 確實攜帶著腫瘤變異訊息，因此 ctDNA 分析可應用於揭開癌症、疾病資訊的重要工具之一。

採血取得 cfDNA 為非侵入性的取樣方法，優點在於可避免進行手術採樣的麻煩，通常在腫瘤發展過程，ctDNA 含量會隨之增加，因此定期抽血進行 ctDNA 基因分析，可用於追蹤腫瘤病患的病情，也相較簡易。不過，由於 ctDNA 含量很低 ( 在腫瘤生成早期僅佔約 0.1% cfDNA )，因此除了晚期腫瘤 cfDNA 樣品，大多腫瘤病患的 ctDNA 因濃度過低而無法獲得有效基因分析。

隨著 NGS 技術靈敏度的大幅提升，已彌補稀少樣品 ( ctDNA ) 被定序分析的困難，下一步，需要考量 cfDNA input 最低標準需求量，以保證取得可信的定序數據。

因此，有關 cfDNA 樣品的 QC 判斷包含：

( 1 ) 長度：符合 cfDNA 片段大小的範圍為 50 – 700 bp。

( 2 ) 含量：判斷 cfDNA 在樣本中的濃度，經綜合分析確認實際的 cfDNA 含量足以通過可進行有效 NGS 分析的最低樣品需求量 ( cfDNA input )。

血液中包含 HMW-gDNA 以及許多 cfDNA，一般核酸定量 ( Qubit ) 僅能定量全部核酸，無法偵測樣品 gDNA 的汙染狀況，往往高估樣品濃度 ( 圖一 )，使實際 cfDNA input 不足。使用 Agilent TapeStation 系統 ( 圖一、二 )，則可以分析樣本內不同核酸片段的分布、並自動計算 %cfDNA 作為準確定量 cfDNA 實際濃度的指標。

【圖一】Qubit 定量法無法判別真正實際的 cfDNA 濃度

【圖二】Agilent TapeStation 自動計算 %cfDNA 作為 cfDNA 的含量指標

當 ctDNA input 越少，會造成定序覆蓋率降低，以 illumina TrueSight^TM Oncology 500 ctDNA assay 而言，最少需使用 30 ng ctDNA input 進行實驗 ( 圖四 )，則有 90% 樣品達 2000 counts。而癌症患者血液中 cfDNA 含量會多於健康個體血液，自癌症來源樣品建議至少採 6 ml 的血漿，以取得 30 ng cfDNA ( 圖三 )，一般健康血液樣本則需 10 ml 的血漿。

【圖三】30 ng cfDNA 需求建議自癌症患者採集 6 ml 血漿 ( illumina TrueSight^TMOncology 500 ctDNA )

【圖四】30 ng ctDNA 有 90% 樣品可達 2000 counts 覆蓋度 ( illumina TrueSight^TMOncology 500 ctDNA )

為了 ctDNA 定序結果的有效性、可信度，使用充足的 cfDNA input ( 長度 50 – 700 bp ) 進行 NGS 實驗，才能維持、確保優化的定序表現，選擇 Agilent TapeStation 系統可分析血液樣品中其他核酸汙染狀況，以 %cfDNA 數據，準確定量、評估 ctDNA 的真正濃度，確保每一次 NGS 分析獲得癌症疾病中有意義的突變訊息。

【參考資料】

1. https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/appnotes/cfdna-quantification-tech-note-1170-2020-001.pdf