HMW-DNA 與三代定序的全新應用

隨著定序技術演進至今，揭開基因體蘊含的訊息不再困難，從最早的 Sanger Sequencing，2000年後次世代定序 ( NGS, Next Generation Sequencing ) 的廣泛使用，一直到三代定序 ( Third Generation Sequencing ) 的誕生，滿足自研究擴及臨床的各項需求，舉凡生物基因相關，微生物環境保護、動植物育種技術改良、基因檢測等，依實驗目的，各世代定序各有相異延伸應用 ( 表一 ) 。

【表一】一、二、三代定序比較

第三代定序 ( long read sequencing ) 特色為一次讀取大量長片段序列、直接定序核酸分子，包括兩大技術平台：

 1. Pacific Bioscience ( PACBIO )：
SMRT ( single molecule, real time ) 技術，讓每一條核酸分子在極小的通道進行聚合反應的過程，同時偵測四種螢光標記 dNTP 被合成的螢光訊號。

 2. Nanopore sequencing：
利用一次僅容許單鏈核酸通過的奈米孔技術，測量不同鹼基經過時產生的電流變化，藉以分析序列。

【表二】三代定序技術比較

基於快速、讀取單一長片段 DNA / RNA 分子的技術特性，三代定序解決過去定序技術上的難題。因 NGS 讀長短，易使在計算、重建原始序列時更加複雜化，長片段定序較利於 de novo 拼裝、保持 mapping 正確性。目前三代定序較明確、成熟的應用於：

1. DNA — 人類多樣性與疾病研究：
讀取長片段可覆蓋基因體大量重複區域、增進基因體組裝效率，對於新物種基因組發現、≥50 bp 結構型變異偵測、染色體 Haplotyping 分析，展現極大優勢，是研究基因體多樣性、與人類疾病的重要資訊來源。

2. RNA — 基因表現差異性：
RNA splicing 是真核生物表現不同功能性基因的主要機制，三代定序可讀取全長 transcript，不須經過 NGS short read 瑣碎的組裝，可全面辨別樣品中原始的 RNA isoform。

3. Epigenomics：
藉由直接針對 DNA / RNA 分子定序，檢測原始樣本鹼基的修飾位，將訊號與 Reference genome 序列比對，以找出基因修飾區域，為表觀遺傳研究的有效工具。( 圖一 )

【圖一】PACBIO 與 Nanopore 在 DNA / RNA modification 的分析方式

4. Metagenomics：

PACBIO 的 HiFi Metagenomic Sequencing，直接定序分析環境微生物的基因體，獲得環境中微生物的族群與分布，並可辨識出微量種群 ( 0.018% Abundance ) 。( 圖二 )

【圖二】PACBIO 在 Metagenomics 的應用

良好的定序實驗，需要合適的樣品配合合適的定序技術分析。由於三代定序一次讀取長片段序列的技術特色，準備高純度、完整的長片段樣品 — HMW DNA ( 下一篇將介紹三代定序樣品需求 ) ，可使得定序效能更佳，並可解決許多過去定序技術的弱點，滿足基因體學其他特殊研究的應用需求，但目前仍面臨通量、成本、定序效能、準確率等問題，若能逐步解決，在未來仍具有很大的發展能量與應用價值。

【參考資料】
1. Amarasinghe et al. Genome Biology (2020) 21:30
https://doi.org/10.1186/s13059-020-1935-5
2. https://www.pacb.com/wp-content/uploads/Ashby-CSHL-Microbiome-2019-Unbiased-characterization-of-metagenome-composition-and-function-using-HiFi-sequencing-on-the-PacBio-Sequel-II-System.pdf