1.樣品條件：起初的樣品破碎或不易取得，將會大幅提升後續處理難度，影響操作通量，時間成本增加
2.基因抓取內容：探針設計與製備試劑成本反映於預計分析的基因區域，與該抓取範圍大小及序列複雜性有關
3.定序分析：取決於實驗的數據量多寡、定序深度需求，以及分析設備、軟體執行的成本
隨著不同實驗屬性，以上成本控制條件尚需做更複雜的改進調整，才能讓每一次的實驗達到最佳化，現階段，為使臨床 WES 研究更經濟、省成本，方便大量操作，提升定序通量、簡化操作流程是最直接、相較單純、經濟化的改善方式，現今多以混樣 ( pooling ) 處理 NGS 樣品建庫來降低實驗成本。
WES 常見應用為癌症、遺傳，由於兩者實驗條件差異，適當選擇建庫混樣法，可獲得更有效益的結果。癌症基因定序的特性：樣品異質性高、臨床樣品 ( FFPE ) 完整性差，而需要定序靈敏度更高，才可以看到真實的基因訊息；而遺傳基因檢測的特質：樣品量與品質需求標準較低，只要具備 50% 突變的偵測力，可容忍較低的定序靈敏度；不同的混樣法會影響後續定序表現，因此，建庫 pooling 方法就顯得十分重要。
捕抓建庫 pooling 方法
▶ Post-capture pooling：
一個樣品對應一份探針，讓探針與樣品進行雜合反應後，不同序列的 sample index 加到每個樣品的文庫上完成建庫，QC 合格的文庫再根據定序數據量的需求混合後，上機定序。
每個樣品與探針分別雜合捕抓，可盡量高度保留每一個文庫的複雜度，特別適合於低頻率突變的偵測，在定序前各樣品都先經過 QC，有效控管其文庫製備的品質，只要不符實驗標準，立即重做，雖然步驟繁複許多，在上機前的混樣，可保持每個樣品的數據量均一，或靈活調整樣品濃度來控制不同的定序量，是較容易預期結果的混樣方式，有助於降低上機定序的失誤率，並能有限度地控制成本。
▶ Pre-capture pooling：
多個樣品對應同一份探針。不同的 sample index 在雜合、捕抓前分別加到每個樣本上，QC 合格的樣品進行等量混樣後，每個混樣 pool 共用一份探針進行雜合捕抓，再上機定序。
共用探針、或探針不足時，各自製備的文庫複雜性較低，duplication 比率隨之提高，影響低頻率變異的偵測效能；且樣品彼此間雜合效率會有差異，導致每個樣品的定序數據量容易不均，難以預期、控制實驗結果，最後反而增加定序成本。Pre-capture pooling 的優勢在於成本更低，合併捕抓讓操作通量提升，較適合樣品間差異性低、或長期經驗累積下，已可確保達到基本定序要求的實驗。
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| 【圖一】post-capture pooling 與 pre-capture pooling 示意圖 |
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| 【圖二】Post-capture pooling 和 pre-capture pooling 對定序數據均一性影響的差異。前者的均一性顯著優於後者 |
Post-capture / Pre-capture pooling 不同的技術特性，影響 NGS 樣品製備效果及後續的定序表現，在定序量大、少量樣品、急件進行的情況下，Post-capture
pooling 是一種更穩定、可靠和靈活的 Exome lib prep 方法；平衡成本與提升通量的需求時，則可斟酌使用 Pre-capture pooling。
▶ post-capture pooling 使用時機：
• 高深度定序檢測低頻率變異。文庫複雜度高，較不易遺漏稀有變異位點；採用 pre-capture pooling，其文庫複雜度低，更可能遺漏、偵測不到突變而實驗失敗重做，增加定序成本。
• 品質差的樣品，如降解程度較高的 FFPE 樣品。完整性差的樣品在定序數據上的均勻度低，獨立捕抓製備文庫能盡量保留每個樣品基因訊息。
• 樣品來源多樣或品質不一致。為了讓樣品間的數據差距不要太大、或保有基本的數據量，通常利用 post-capture pooling 先將每個樣品獨立捕抓建庫再混樣上機，才能有效保留並分析樣品的基因訊息。
▶ pre-capture pooling 使用時機：
• 高品質、充足的樣品量，同時檢測的目標區域較不具挑戰性；
• 滿足高品質、量充足條件的樣品，同時對資料要求較不嚴苛時。
不論 Post-capture pooling 或 Pre-capture pooling，只要符合實驗目的需要的定序表現 / 規格，取得充分、完整的基因資訊，都是可行、可選擇的方法。依據樣品條件、操作穩定性、定序數據需求等綜合考量，挑選相應合適的 Pooling 方法，別為了節省前端的製備成本而犧牲最後定序結果的可靠性，才是真正省下成本、獲得有應用價值結果的最佳選擇。
SureSelect 全外顯子第八代，推出日常基礎 WES 分析 ( Exome V8 )、轉譯醫學 ( Exome V8 + UTR )、臨床研究應用 ( Exome V8 + NCV )，每一種探針應用皆提供 Post-capture / Pre-capture 混樣的試劑組，並能進行自動化 exome 文庫製備，讓每一個 WES 實驗都能穩定、輕鬆、省錢。
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