RNA fusion 實驗演進 ( 上 ) – 人類 48 條染色體 ?? "疏失" 推翻了錯誤認知，讓兩個年輕仔找到 "費城染色體"，促使半世紀後進行癌症 RNA NGS 檢測

張貼者： 日期：
基因融合 ( gene fusion ) 為癌症突變中的一個重要變異，受限於癌症臨床樣品高降解 ( highly degraded )、微量 ( 1-30% tumor 含量 )、高細胞異質度 ( heterogeneous ) 等特性，加上 RNA 因表現量落差巨大 ( ~10^6 dynamic range ) 及複雜的序列剪接、融合 ( splicing、fusion )，基因融合一直以來多以 DNA 層次來分析，而非以 RNA 轉錄本 ( RNA transcript ) 來進行研究。隨著二代、三代定序技術的成熟，常規 NGS 實驗已能很好的解析 FFPE DNA、RNA 樣品，FFPE DNA 已能順利偵測存量 ~1% 的癌症單點突變 ( point mutation )、微片段突變 ( 30-50% 的外顯子層次 ( exon-level ) 增幅或缺失，而 FFPE RNA 樣品，也因 NGS 成本大幅下降與目標抓取 ( target capture ) 技術進步，得以針對目標基因 ( 如 kinase genes, kinome ) 的外顯子甚至是接合處 ( exon junction )，集中分析數億 ( hundreds of million ) 條 cDNA 片段，由 NGS big data 視角進行 資料-假設複合驅動 ( Data-Hypothesis-Driven ) 研究，搜尋新的剪接、融合現象。

歷史中第一個被發現、也最為人所熟知的基因融合事件，當屬慢性骨髓性白血病 ( chronic myeloid leukemia, CML ) 常出現的 Chr9 與 Chr22 的長端區 ( q-arm ) 區段易位 ( translocation, t ( 9;22 ) ( q34;q11 ) )，該現象產生了 Chr22 變異染色體 - 費城染色體 ( the Philadelphia chromosome，簡稱 Ph )，以及易位斷點 ( breakpoint ) 處生成的 bcr-abl1 ( 舊稱 bcr-abl ) 融合基因 17。( 圖一、二 )

【圖一】Philadelphia chromosome ( from NCBI PQD 28 )

【圖二】BCR gene and Bcr/Abl translocation products


Genomics Research History I ( 1882-1960 )


費城染色體發現與研究的技術，最早可追朔到 140 年前，得力於德國光學科技改良了顯微鏡成像，以及染色技術開發，德國科學家 Walther Flemming ( chromosome、chromatin 字詞創名者 ) 得以看見染成深色無細節、輪廓如燈刷的染色體 ( lampbrush chromosome ) ( 1882 手繪圖 )。雖然影像如此有限，但德國的科學家們開始觀察到許多惡性腫瘤的組織切片，具有可見的有絲分裂異常 ( gross mitotic abnormalities ) 現象。後於 1914 年時 Theodor Boveri 提出基因異常與癌症發展假說，第一次將腫瘤生成與基因不穩定變異連結起來，但此時因技術緣故，只能停留在粗略且吃力的觀察，連 1921 年美國科學家 Theophilus Shickel Painter 發表在 Science 期刊的人類染色體數量都不太確定，知道為 45 - 48 條之間 1 , 隨後推定為 48 條，直到了 1956 年才由東爪哇裔科學家 Joe Hin Tjio 與瑞典科學家 Albert Levan 更正為 46 條 2。而 1921-1956 的 35 年間因沒有正確基礎、沒有清晰觀察染色體技術、二戰影響下，未有明確的癌症染色體變異發現。



Genomics Research History II ( 1960-1980 )


科學的進步有時是偶然的，一次技術員調配疏失，使得華裔科學家 Tao-Chiuh Hsu ( 徐道覺 ) 發現低滲透壓鹽緩衝液可以使染色體舒展分散、非常漂亮的呈現，他於 1952 年發表了 Hsu's technique 18，促使了 Tjio & Levan 於 1956 年確定了正確的人類染色體數量 2，正確的基礎加上技術突破，得以使染色體變異顯現，著名的唐氏症即於 1959 由法國醫生 Marthe Gautier 發現與三條 21 號染色體 ( Trisomy 21 ) 有關，以及在 1960 年迎來人類在癌症染色體上的明確變異發現 — 慢性骨髓性白血病 ( CML ) 的 費城染色體 ( the Philadelphia chromosome )。

1956 年，年輕科學家 Peter Nowell ( 戴眼鏡者 ) 加入 University of Pennsylvania ( 簡稱 UPenn ) 進行白血病研究，Nowell 對細胞遺傳學一無所知，彼時 UPenn 內也無人對染色體研究感興趣，後來 Nowell 找到在 the Fox Chase Cancer Center 寫人類染色體論文的研究生 David Hungerfold，兩人一起應用當時最新的細胞、染色體製備技術 ( cell、chromosomal preparation )，觀察到 CML 腫瘤細胞存在微小染色體 ( minute chromosome ) 3；隔年 ( 1961 ) 在 Paul Moorhead 的幫助下改善技術後進一步發表發現，此後微小染色體依循染色體標準化委員會 ( the Committee for the Standardization of Chromosomes ) 的規定以發現地命名，定名為費城染色體 ( the Philadelphia chromosome，簡稱 Ph )。

Ph 染色體的來源，則是在 7-10 年後因 quinacrine fluorescence 與 Giemsa banding 新技術開發，由美國科學家 Janet Rowley 於 1973 年鑑定出 Ph 染色體為 Chr9 與 Chr22 的區段易位 ( translocation, t ( 9;22 ) ) 所產生 5。這段時期，除了染色體技術外，mRNA 與 protein 的關係、RNA 的逆轉錄 ( reverse transcription ) 技術、南方墨點法 ( Southern DNA blotting )、分子選殖 ( molecular cloning, or 分子克隆 ) 技術也陸續發展，使得染色體的分析進入基因層次。而 Ph 染色體的進一步細節，則是 1977 年的革命創新 Sanger sequencing ( 一代 DNA 定序 )，以及新興的分子選殖 ( molecular cloning，又稱分子克隆 ) 技術於 1980 年代交會後，得以獲得解析。



Genomics Research History III ( 1980-1990 )


分子生物學在 1980 年代快速進步，目前常用的經典分子生物學技術幾乎都在這個時期出現，也讓 bcr-abl 融合基因被鑑定出來。

1982 年時 Klein et al. 使用 Abelson murine leukemia virus ( A-MuLV ) 產生的 v-abl 基因探針 ( DNA probe )，加上限制酶定位法 ( restriction mapping ) 做出人類 c-abl 探針，以南方墨點法確認人類 abl 基因不在正常的 Chr9 位置上 ( 9q+ )，而是出現於易位後的 Ph 染色體 ( 22q- ) 7, 8。

1984 年同一團隊利用一段 Ph 的易位斷點區片段 ( the Philadelphia ( Ph' ) translocation breakpoint domain ) 作為探針，釣出 Chr22 上對應的一段 5.8 kb 斷點片段，稱呼它 " breakpoint cluster region " ( bcr ) 10，此時還不知道 bcr 是否為基因。接著該團隊以該 5.8 kb 片段做探針釣出了 cDNA，該 cDNA 存在一個蛋白質的 C-terminal end 部分，再以該 cDNA 作為探針，確定出易位斷點相對於外顯子的位置，顯示易位斷點是發生在內含子 ( intron )，由於該基因與此前分離的其他基因沒有同源性，因此被命名為 bcr 基因，此後使用 abl 和 bcl 的探針分析了 CML 病人的 RNA，證明了嵌合 BCR / ABL mRNA 存在 11。

1986 年，Mes-Masson et al. 利用將數個 cDNA clones 進行定序，拼湊出完整的 Bcr-Abl 編碼序列 ( complete coding sequence ) 12。有了 coding 序列之後，搭配 1983 年發明的 PCR 基因增幅技術，於 1988 年產生針對 fusion RNA 的 RT-PCR 診斷應用 14，至此 Ph 染色體的本質，以及融合處生成的 bcr-abl1 ( 舊稱 bcr-abl ) 融合基因的完整 mRNA 編碼序列，已大致釐清。相對於 mRNA 的完整編碼序列在 1986 年已獲得，因染色體斷點落在富含重複序列 Alu repeat element 的 intron 上，直到 1995 年用霰彈法 ( shotgun strategy ) 定序完成數個易位斷點區的 cosmid 與 plasmid clones 的 DNA 序列，靠著比對各 clones 對應的 cDNA 序列，才將大致的 abl 與 bcr 完整基因定序出來，完成斷點準確定位，而斷點準確定位後也發現不同 CML 病人的 DNA 斷點沒有一致性 15。



Genomics Research History IV ( 1990-2010 )


1990 年之後，得力於 Sanger 定序的改進以及電腦應用的進步，有越來越多的融合基因被找到 26，同時也使人類基因體計畫 ( Human Genome Project, HGP ) 成為可行，並於 2001 取得第一份人類基因圖譜，這個時期技術著重在微小化、提升通量，因此毛細管 Sanger 定序儀與生物晶片 ( micro-array ) 於 1995 年後進入應用，而這兩個技術也進行了技術融合，10 年間將定序的 PCR、螢光偵測微縮在 microarray 上進行，於 2005-2006 成為了 NGS ( Next Generation Sequencing，次世代定序 )，同時生物晶片所用的高通量探針合成 ( probe synthesis ) 技術，也轉化為外顯子體、基因抓取 ( Exome、Gene capture ) 所用探針，於 2009 由 Agilent Technologies 與 Broad Institute 合作用於 fusion transcripts 的 RNA 抓取定序 22 23 24。自此，RNA fusion 研究進入以 NGS 技術為主的時代。



【圖三】Discovery of fusion coincides with improved DNA sequencing technologies. ( From Ref 26 )

【圖四】Fusion genes and their methods of discovery. ( From Ref 26 )

【圖五】Fusion location in the human body ( From Ref 26 )


回顧這段 128 年歷程，幾個概念值得參考：
a. 技術發展帶動了科學的前進
b. 技術突破更正了錯誤的已知，促使新的發現
c. 領域重大發現通常在技術突破後 5-10 年間發生
d. DNA 好取得所以先分析，但因為基因融合的 DNA 斷點處需要克服 repeat elements 與不固定問題，反而斷點精確定位是最晚完成的
e. RNA ( cDNA ) 因在 splicing 過程把 repeat-rich 的 intron 丟掉，而且有較為固定的 exon-exon junction，只要能釣出 RNA 就成功一半
f. 1982-1986 間的 Bcr-Abl 鑑定工作，用到許多 cDNA probe 釣序列、片段定位、序列解析，這與 2022 年使用的 RNA capture + NGS 定序實驗概念一模一樣

下一篇，我們來看 2022 年的現在是如何進行 RNA fusion 研究與診斷 27





【參考資料】
1. Painter TS. (1921) “THE Y-CHROMOSOME IN MAMMALS.” Science. 53(1378):503-4. 

2. JOE HIN TJIO, ALBERT LEVAN. (1956) “THE CHROMOSOME NUMBER OF MAN” Hereditas.

3. P. C. Nowell and D. A. Hungerford (1960) “A Minute Chromosome in Human Chronic Granulocytic Leukemia” Science. Vol. 132, 1960, p. 1497.



6. KOTTLER, MALCOLM JAY. (1974) “FROM 48 TO 46: CYTOLOGICAL TECHNIQUE, PRECONCEPTION, AND THE COUNTING OF HUMAN CHROMOSOMES.” Bulletin of the History of Medicine. Vol. 48, No. 4: 465-502

7. de Klein A, van Kessel AG, Grosveld G, Bartram CR, Hagemeijer A, Bootsma D, Spurr NK, Heisterkamp N, Groffen J, Stephenson JR. (1982) “A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia.” Nature 300, 765-767. 

8. Okayama H, Berg P. (1982) “High-efficiency cloning of full-length cDNA.” Mol Cell Biol. 2(2): 161–170.

9. Heisterkamp, N., Stephenson, J., Groffen, J. et al. (1983) “Localization of the c-abl oncogene adjacent to a translocation break point in chronic myelocytic leukaemia.” Nature 306, 239–242.

10. Groffen J, Stephenson JR, Heisterkamp N, de Klein A, Bartram CR, Grosveld G. (1984) “Philadelphia chromosomal breakpoints are clustered within a limited region, bcr, on chromosome 22.” Cell 36(1):93-9.

11. Stam K, Heisterkamp N, Grosveld G, de Klein A, Verma RS, Coleman M, Dosik H, Groffen J. (1985) “Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome.” N Engl J Med. 313:1429-1433


13. Hermans A, Heisterkamp N, von Linden M, van Baal S, Meijer D, van der Plas D, Wiedemann LM, Groffen J, Bootsma D, Grosveld G. (1987) “Unique fusion of bcr and c-abl genes in Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia.” Cell 51(1):33-40.

14. Kawasaki ES, Clark SS, Coyne MY, Smith SD, Champlin R, Witte ON, McCormick FP. (1988) “Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro.” Proc Natl Acad Sci U S A. 85(15):5698-702.

15. Chissoe SL, Bodenteich A, Wang YF, Wang YP, Burian D, Clifton SW, Crabtree J, Freeman A, Iyer K, Jian L, et al. (1995) “Sequence and analysis of the human ABL gene, the BCR gene, and regions involved in the Philadelphia chromosomal translocation.” Genomics. 27(1):67-82.

16. Jeffs AR, Benjes SM, Smith TL, Sowerby SJ, Morris CM. (1998) “The BCR gene recombines preferentially with Alu elements in complex BCR-ABL translocations of chronic myeloid leukaemia.” Hum Mol Genet. 7(5):767-76.**

17. Heisterkamp N, Groffen J. (2002) “Philadelphia-positive leukemia: a personal perspective.” Oncogene. 21(56):8536-40.

18. Pathak S. (2004) “T.C. Hsu: In memory of a rare scientist” Cytogenet Genome Res 105:1–3

19. Gartler SM. (2006) “The chromosome number in humans: a brief history.” Nat Rev Genet. 7(8):655-60.**

20. Nowell PC. (2007) “Discovery of the Philadelphia chromosome: a personal perspective.” J Clin Invest. 117(8):2033-5.**

21. Timothy J. Ley, Elaine R. Mardis et al. (2008) “DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome.” Nature. 456(7218):66-72.**

22. Guffanti A et al. (2009) “A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing.” BMC Genomics.10:163.

23. Levin JZ, Berger MF, Adiconis X, Rogov P, Melnikov A, Fennell T, Nusbaum C, Garraway LA, Gnirke A. (2009) “Targeted next-generation sequencing of a cancer transcriptome enhances detection of sequence variants and novel fusion transcripts.” Genome Biol. 10(10):R115.

24. Maher CA, Kumar-Sinha C, Cao X, Kalyana-Sundaram S, Han B, Jing X, Sam L, Barrette T, Palanisamy N, Chinnaiyan AM. (2009) “Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer.” Nature. 458(7234):97-101.

25. Knutsen T. (2011) “The Philadelphia chromosome: celebration of the 50th anniversary of its discovery.” J Assoc Genet Technol. 37(1):5-10.**

26. Parker BC, Zhang W. (2013) “Fusion genes in solid tumors: an emerging target for cancer diagnosis and treatment.” Chin J Cancer. 32(11):594-603.

27. Curry PDK, Broda KL, Carroll CJ. (2021) “The Role of RNA-Sequencing as a New Genetic Diagnosis Tool.” Current Genetic Medicine Reports. 9(2):13-21.

留言

張貼留言