東京大學醫院 DNA、RNA 癌症檢測 SureSelect Exome 開發

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全外顯子 ( Whole Exome Sequencing, WES ) 定序技術推出後，許多突變在 ~18,000 蛋白質基因一次全掃描下都能被鑑定出來。WES 雖具有許多的效益，但對於臨床應用的樣品條件、整體成本、責任範圍挑戰，還需做最適化修改，挑選基因成為主題式檢測，將定序資源善用在極具臨床意義的 100 - 600 個基因 Panel 上。而 WES 通常用於無時間壓力的遺傳病因探詢，或作為 NGS Panel 開發時的 TMB、MSI 比對基準。

2017 年，日本東京大學醫院使用 Agilent SureSelect 開發癌症檢測 Panel — Todai OncoPanel ( TOP )，TOP 系統為了因應 DNA 及 RNA 兩種不同檢測需求，所以將之設計成雙 panel 系統 ( twin-panel system )，這樣即能以分別最佳化的設計，分別掃描 DNA 與 RNA 的變異，其研究 / 開發資訊：

1. 雙檢測內容


【 Fig1. TOP twin‐panel 】

( 1 ) DNA Panel – 464 個基因的 SNV、indels、CNV，及其 TERT promoter 突變偵測。
( 2 ) RNA Panel – gene fusion、exon skipping 偵測，與 ( 或 ) RNA expression 分析。


• gene fusion

RNA 分析是更合適而有效率找到基因融合的方式，使用 junction capture 技術開發捕抓 RNA fusion ( Fig2 )，split read 越多表示偵測到越多發生融合的位點 ( Fig3A )，使用 SureSelect 系統針對重要目標基因客製設計、結合 junction capture 技術捕獲 RNA fusion，可大幅減少探針 ( Fig3B )、捕抓範圍 ( Fig3C ) 的成本 ( 減少 ~ 14倍 )，是臨床在經濟與效能雙重考量下的理想選擇。

【 Fig2. Exon junction capture method. 】

Capture probes were designed to target the cDNA sequences within 120 bases from the estimated fusion junctions to efficiently and specifically obtain split reads that support the fusion transcript.

【 Fig3. Efficiency of the junction capture method. 】


• exon skipping

由於 MET 外顯子跳躍 ( MET exon 14 skipping ) 與多種癌症形成有關，該團隊進一步評估 junction capture RNA-seq 是否可有效偵測 exon skipping 變異所產生的異常 transcripts，對比正常樣本 ( Fig4A, Case #27 )，RNA-seq 可確認 exon skipping 發生位置，TOP RNA panel 在 5 個 FFPE 樣本 ( Fig4B, Case#39~43 ) 成功識別 MET exon 14 skipping，而在其他 34 例無 MET 突變者 ( Fig4B, Case#1~34 ) 之中，未檢測到突變訊號。

【 Fig4. RNA-seq reads for a MET exon 14 skipping. 】

RNA-seq was performed using three different methods: poly(A) selection of RNA (NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit, NEB) and coding exon capture (TruSight RNA Pan-Cancer Panel, Illumina) or junction capture (Agilent SureSelect Custom) of cDNA.


• gene expression

接著開發團隊選了 7 個做了 TOP RNA panel 的癌症案例，取其冷凍樣品進行了一般 polyA RNA-seq 實驗，兩者皆對目標基因群計算表現量 RPKM 數值。兩兩比對 TOP Panel 的 FFPE RNA 數值與 polyA RNA-seq 的冷凍樣品 RNA 數值 ( Figure 5 )，兩著高度一致，顯示 TOP RNA Panel 可以良好呈現基因表現量資訊。

【 Figure 5. Validation of expression analysis using the TOP RNA panel. 】

Expression analysis was performed for 7 tumors to compare the performance of the TOP RNA panel using FFPE specimens with that of RNA-seq using frozen specimens and poly(A) mRNA enrichment.


• sequencing success rate

最後審視樣品量與定序成功率的關係 ( Figure 6, 7 )。DNA panel ( Figure 6 ) 的整體成功率為 84%，其中 DNA 樣品符合最適量 500ng 時成功率為 98%；1-50ng 樣品的成功率最差只有 50%，但如果有成功定序的還是可以獲得有用的資訊。RNA panel ( Figure 7 ) 整體成功率為 85.4%，符合最適量 500ng 時成功率為 88%；1-50ng 樣品的成功率為 36% ; 當加入 DV200 來偕同評估時，樣品 RNA > 200ng 且 DV200 > 40% 時具有 100% 成功率。
【 Figure 6. TOP DNA panel sequencing success as a function of specimen characteristics. 】

【 Figure 7. TOP RNA panel sequencing success as a function of specimen characteristics. 】



2. 臨床測試與研究

TOP 一共偵測了 315 個臨床樣本、10 種以上的癌別；根據不同程度 / 可行性的治療措施 ( Figure 8 )，將每個樣本分配到合適的級別 ( Figure 9 )，TOP 檢測為後續可採取的治療方針，提供了實質參考。

【 Figure 8. TOP evidence level classification. 】

The evidence level classification used to annotate gene alterations in TOP testing is indicated. PMDA: Pharmaceuticals and Medical Devices Agency; FDA: Food and Drug Administration.


【 Fig9. Clinical actionability of somatic alterations revealed by the TOP. 】

The levels vary according to whether the mutations are a Pharmaceuticals and Medical Devices Agency‐recognized biomarker (Tier 1), a Japanese clinical trial‐targeted biomarker or a US Food and Drug Administration‐recognized biomarker (Tier 2), an investigational agent sensitizing gene alteration or an oncogenic alteration supported by a knowledge database (Tier 3), an oncogenic alteration supported by a research paper (Tier 4) or a recurrently reported alteration in a knowledge database.


Todai OncoPanel ( TOP ) 的開發，能夠對 FFPE 樣本中的癌症相關基因進行全面的分析，且能實用在癌症診斷、對應於臨床現行的治療方案，依循著臨床正規標準 ( CLIA-lab ) 建構一套完整的定序流程系統 ( Fig10 )，提供可信的分析報告，加速精準醫療發展、實踐精準治療。

【 Fig10. TOP clinical sequence workflow. 】



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