子癲前症 plasma cell free RNA ( cfRNA ) 研究的 SureSelect 應用

液態活檢 ( liquid biopsy ) 技術，已成功應用在 DNA 層次的臨床檢測中，像是癌症突變或非侵入式母血唐氏症篩檢，然而 cfRNA 因技術與分析方法具更高門檻，因此未成為檢測的主流標的。近來在 RNA exome 抓取技術的進步下，FFPE、cell free 挑戰性 RNA 樣品的基因表現 ( expression )、RNA fusion 偵測等已能輕鬆完成，而 cfRNA 也逐漸成為新的檢測開發目標。2022 年 1 月 Nature 期刊發表了 cfRNA 於妊娠子癲前症預測的臨床研究，由美國懷孕併發症預測平台 — Mirvie 公司與 Brigham and Women's Hospital ( BWH, 哈佛醫學院主要教學醫院之一、Dana-Farber 癌症研究所合作醫院 ) 合作，針對懷孕惡性風險極高的子癲前症，獲得了高度可行的 cfRNA 臨床成果。

子癲前症發生率約 2 – 8% 1，產婦出現高血壓合併蛋白尿等症狀，主要是胎盤功能不良所致，使胎兒生長遲緩、早產，嚴重則可能有致死風險，根據統計，是造成台灣產婦、胎兒死亡的三大主因之一 2。因此 Mirvie 與 BWH 合作收集了橫跨 5 - 40 妊娠週數的 1840 位不同種族、國籍、地區、社經狀態的孕婦，共 2539 個 plasma 樣品 ( Fig. 1a )，進行懷孕期間的子癲前症母血 cfRNA 基因表現分析，相關研究內容為：


● 樣本收集與處理

自每個樣本 0.215 – 1 mL 的 plasma 萃取 cfRNA 並純化之，使用 Agilent SureSelect 系統進行 RNA capture、建庫、定序。

【Fig 1. Overview of plasma sampling and cohorts and gestational age modelling.】

a, Cohorts are labelled A–H (Table 1). Circles represent plasma samples from liquid biopsies (n = 2,539). Colours represent the race of the maternal donor. b, Model predictions from the hold-out test (n = 474) using cfRNA transcript data in the Lasso linear model versus ultrasound-predicted gestational age. The dark grey zone represents 1 s.d., and the light grey zone represents 2 s.d. c, Variance explained from ANOVA.

● 研究結果

1. cfRNA 的孕齡 / 胎齡預測模型

研究團隊以 Lasso linear model 建立 cfRNA 的妊娠週數機器學習模型，cfRNA 數據先依妊娠週數區分並做基因表現量正規化，再將 2,539 個 cfRNA 分為 training set ( n=1,908 ) 及 test set ( n=4,74 ) 兩組，進行胎兒特定週數的對應基因表現模型訓練，結果顯示模型 ( Gestational age model ) 與超音波預測的第二、第三孕期結果相當 ( Fig 1b )，可作為懷孕婦女產前檢查另一種新的檢測方式。此妊娠週數預測模型幾乎只與 cfRNA 訊號有關，不受產婦種族、年齡、BMI 等變數影響 ( Fig 1c )。

2. 孕期的生物表徵變化

cfRNA 表現特徵顯示了懷孕過程的基因動態變化，研究團隊試著探討母血中的 cfRNA 表現特徵主要是來自胎盤、胎兒、或子宮等相關來源。該團隊首先證實 cfRNA 中存在賀爾蒙分泌 ( gonadotropin and oestrogen pathways ) 相關基因，並且，資料庫中的胎盤主題基因群 ( gene sets ) 於 cfRNA 裡的占比也隨著孕程具有與 gestational age model 一致的增加趨勢 ( Fig 2a,b )，另外也看到母血 cfRNA 中數百組的主題基因群能映射胎兒生理變化。研究團隊特別應用了成人或胎兒器官的 single-cell RNA-seq 數據，確認了母血 cfRNA 中有胎兒相關基因群，像是胎兒心臟發育基因的表現變化 ( Fig 2c )；以及 cfRNA 能反應孕程中母體子宮 / 宮頸的膠原蛋白與 extracellular matrix ( ECM ) 基因群的增加 ( Fig 2d )。這些主題基因群，在不同人群類別 ( Tab 1 ) 中皆具有類似的妊娠週數 - 基因表現上升趨勢 ( Fig 2e–h )。

【Fig 2. Temporal profiles of pregnancy pathways for gene sets from the gestational age model and independently identified gene sets for placenta, developing fetal heart and collagen extracellular matrix known to be involved in uterus and cervix growth over gestation.】

a–d, Maternal plasma transcriptome fractions for gene sets averaged across all samples in each collection window. Gestational age model (a), placenta (b), developing heart (c) and collagen extracellular matrix (ECM) (d). Error bars correspond to the 95% confidence interval around the mean. CPM, counts per million. n = 93 for each time point and gene set. e–h, Signal across all cohorts with longitudinal data: gestational age model (e), placenta (f), developing heart (g) and collagen ECM (h). Linear fits are shown of transcriptome fractions for all samples across corresponding gestational ages recorded at collection times. The band around the solid line corresponds to the 95% confidence interval. All slopes for the gestational age coefficients are distinct from 0 at a confidence level of 0.05. Cohort is indicated by colour.

【Tab 1. Sample Overview】

3. cfRNA 的子癲前症早期預測

在確認 cfRNA 能顯現妊娠進程 ( 母體 — 胎盤 — 胎兒 ) 的分子變化特徵後 ( Fig 2 )，接著觀察第二孕期 ( 16 – 27周 ) 中是否有子癲前症造成的代謝途徑基因群 cfRNA 擾動。研究團隊以 case-control study 模式分析 cfRNA 數據，母血的採樣是從子癲前症尚無症狀的懷孕時期 ( 分娩前平均 14.5 周 ) 直至分娩 ( Fig 3a )，而子癲前症的案例是由醫生基於 2013 年 Task Force on Hypertension in Pregnancy ( ACOG 2013 ) 進行診斷而來。交互計算後發現有 7 個基因 ( CLDN7、PAPPA2、SNORD14A、PLEKHH1、MAGEA10、TLE6、FABP1 ) 穩定的具有統計顯著性 ( Fig 3b )。這些基因在數據群體子癲前症 13.7% ( 72陽 / 524例 ) 患病率下，具有 75% sensitivity ( 偵測靈敏度 )、32.3% PPV ( 陽性預測率, positive predictive value ) ( Fig 3c )，此結果較目前方法學 4.4% PPV 為佳，並且不受母體 BMI、年齡、族群影響。另外在比對子癲前症 " 預測-陽性 ( test-positive ) "、" 預測-陰性 ( test-negative ) " 族群的分娩週數時，發現陽性個體存在顯著的早產現象 ( Fig 3d )，母體血液 RNA 分析能於出現臨床徵兆的 3 個月多前檢出 73% 的早產案例，具有早期預測特性。

【Fig 3. Features and model performance for prediction of pre-eclampsia.】

a, Sample collection time (dashed lines) and delivery time (solid lines) for women with pre-eclampsia (purple and green) and controls (grey). Gradients illustrate timelines for developing pathophysiology and onset of clinical symptoms. b, Quantile–quantile plot of ranked Spearman P values for women with pre-eclampsia (cases) versus controls. P values were calculated from Spearman correlation on cohort-corrected data for each gene. The genes used in the model are labelled. The black dotted line represents the expectation. c, Receiver operating characteristic curve (mean and 95% confidence interval) for the logistic regression model for pre-eclampsia (n = 524). d, Kaplan–Meier curves of deliveries in test-positive and test-negative populations (n = 439), excluding spontaneous preterm deliveries.

這項研究除了收集了目前為止最大量、最多樣化的母體 cfRNA 數據，應用於來自不同種族婦女的產前檢查與預測，也顯示了 cfRNA 的 liquid biopsy 鑑別性，提供不受母體 BMI、年齡、族群影響的妊娠風險評估，並反應出疾病生理的進程。在未來 liquid biopsy 技術更加成熟後，其臨床追蹤的方便性，將能許多疾病在不同時間點對人體的影響，逐漸解析出臨床意義並進行預測，對於如產前檢測、晚發性遺傳疾病、癌症預後追蹤等，皆有極大幫助。這個 cfRNA 基因的研究開啟了新的醫學角度與治療契機，有望能降低產婦、新生兒的發病率和死亡率。

【參考資料】
1. https://www.nature.com/articles/s41586-021-04249-w#Sec24
2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3871181/
3. https://www1.cgmh.org.tw/intr/intr2/c4710/contents/m/38-4.htm