【SureSelect RNA Capture 應用介紹 - 3】復發性 RNA fusions 的存在，定義出瀰漫性胃癌 ( diffuse gastric cancer, DGC ) 預後最差族群

RNA fusion ( 融合基因 ) 的存在越來越被重視，一方面 RNA fusion 反應了癌症染色體上的結構變化，另一方面也增加了用藥的可能性。癌細胞的染色體中，常常出現如 Amplification、Deletion、Translocation、Structure Variation、LOH、MSI 等變異，這些變異的存在部分已有對應的預後、用藥指引。RNA fusion 源自於染色體結構變異，因此也成為潛在的可採取治療行動標的 ( actionable target )，若再進一步探討 fusion transcript 的 5' 端 partner gene 或 3' 端 partner gene 的序列，如存在訊息傳遞 / 調控功能區序列，則可以進一步探討可能的致病機制，以及研發調控對抗藥物。

2018 年韓國國家癌症中心於 Nature Communication 上發表了一篇瀰漫性胃癌 ( diffuse gastric cancer, DGC ) 的 RNA fusion 成果 ( ref 1 )。胃癌在韓國發生率為 12.5% ( 2020 年 IARC 數據 )，除了是韓國發生率最高的癌種外，也是全世界胃癌發生率最高的地區。胃癌依組織分有腸型 ( intestinal-type ) 及瀰漫性 ( diffuse-type ) 兩種。除了組織差異外，兩種胃癌在幽門螺旋桿菌 ( H. pylori ) 致癌性流行病學 ( epidemiology of carcinogenesis ) 上也有所差異 ( ref 2 )，但過往的胃癌研究多以腸型為主，並以腸型胃癌的認知套用於瀰漫性胃癌，因此韓國國家癌症中心投入瀰漫性胃癌的分子機制與預後指標研究。

韓國國家癌症中心團隊先前以 DNA 層次出發，分析 80 位 DGC 患者的 SureSelect WES 數據，發現早發性 DGC ( <45 years ) 較一般 DGC ( 50–70 years ) 高出 24.8% 的 CDH1 癌症突變率 ( ref 3 )，帶有 CDH1 癌症突變也有高機會發展成惡性的 HDGC ( hereditary diffuse gastric cancer )。此次研究延伸入 RNA 層次，找到與預後高度相關的 RhoGAP domain-containing fusions 及 PPAPDC1A fusions. 以下是韓國國家癌症中心以 225 人的高品質檢體，搭配 SureSelect RNA Capture Panel 進行 target RNA sequencing，找出 DGC 發生率及預後關聯性高的 RNA fusions 摘要內容：


1. 25 個功能相關的 in-frame RNA fusions

研究團隊為了篩選出高可靠度的 fusion candidates，由具有完整臨床資料 ( 包含 MSI、EBV 測試 ) 的 80 位未經化 / 放療的早發性 DGC ( ≤ 45歲 ) 韓國患者，取得腫瘤、周邊正常組織的冷凍樣本，每個案例使用 1-2 ug 高品質 RNA 進行 polyA RNA-seq 定序以及 RNA fusion 預測分析，再以 RT-PCR 驗證 in-frame fusion candidates，最後確認有 25 個 in-frame RNA fusions ( Figure 1b、1c ) 存在。這 25 個 fusions 有 1 個在 TCGA 胃癌數據庫中出現 ( CLDN18-ARHGAP26 )；而 24 個 RNA fusions 未曾於已知胃癌研究中發現。這 24 個未曾發現的 RNA fusions，其中有 8 個 fusions 的 5' 端或 3' 端 fusion partner 曾出現於 TCGA 胃癌數據中，以及 1 個未與胃癌關聯但為臨床已知的 EML4-ALK。全部 25 個 RNA fusions 的 3' 端 partner gene 多具有高度表現，如 EML4-ALK fusion 的 ALK 部分、UBE2L3-MAPK1 fusion 的 MAPK1 部分 ( Figure 1a )。分析這 25 個 fusion 的 3' 端 partner gene 的基因功能，發現與 Rho GTPase pathway 顯著相關 ( P = 0.01 )，Rho GTPase pathway 與細胞型態、存活、增生與黏著相關，暗示 gene fusions 可能造成了相關影響。

Figure 1｜Twenty-five in-frame gene fusions identified in a discovery dataset of 80 early-onset DGCs

(a) Top panel, Expression level of ALK in the tumor containing the EML4-ALK fusion (magenta circle). Each circle represents each tumor. Sample ordering according to ALK expression level. Bottom panel, Expression level of MAPK1 in the tumor containing the UBE2L3-MAPK1 fusion (magenta circle). Sample ordering according to MAPK1 expression level. (b) Circos plot for the 25 in-frame fusions. (c) Exon-level, Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped (FPKM) values for the in-frame gene fusions. Heatmap after gene centering. Dotted lines, mRNA breakpoints; Red, higher expression level; Blue, lower expression level. In a majority of fusions, 3' partner genes overexpressed exons that were located 3' to the break points.

2. 帶有 RhoGAP domain 的三個復發性 in-frame fusion

為了更全面評估這 25 個 RNA fusions 在不同類型 DGC 中的臨床或生物意義，因此將樣本族群由 80 人擴增至 384 人，包括了 249 位晚發性 DGC 的老年 ( ≥ 46歲 ) 患者，以 RT-PCR 測試所有樣品中這 25 個 RNA fusions 的表現狀況。有 3 個 RNA fusions，CLDN18-ARHGAP26、CTNND1-ARHGAP26、ANXA2-MYO9A ( Figure 2 )，具有復發性 ( recurrent, present in ≥ 2 samples )。這 3 個 RNA fusions 的 3' 端 partner gene 皆有 RhoGAP domain，在 4.4% ( 17 in 384 ) 的腫瘤樣品中可以偵測出，並且對應的周邊正常組織中未被檢出，暗示他們的出現代表了腫瘤變異。

Figure 2｜Schematic representation of three recurrent RhoGAP domain-containing fusions
(a) Chromatogram for the RT-PCR sequencing data. Dotted red lines, mRNA breakpoints. (b) Top panel, the CLDN18-ARHGAP26 fusion. Middle panel, the CTNND1-ARHGAP26 fusion was composed of the Armadillo (Arm) family domain of CTNND1 that is involved in cell-cell adhesion and signal transduction and RhoGAP and SH3 domains of ARHGAP26. Bottom panel, the ANXA2-MYO9A fusion was composed of 99 amino acids in the N-terminal portion of ANXA2 and the protein kinase C conserved region 1 (C1) and RhoGAP domain of MYO9A.

3. RhoGAP domain fusion 的臨床關聯性

17 個具有 RhoGAP domain fusion 的 DGC 案例只有 1 例是 Microsatellite unstable tumor 且都為 EBV-negative，以性別、腫瘤位置、TCGA 分子分群來分析，RhoGAP domain fusions 的存在未見到顯著的分群差異。

由預後狀況來進一步分析，發現 RhoGAP domain fusions 的 DGC 案例 ( n = 17, median survival: 29.1 month ) 的預後明顯低於 ( P = 0.011 ) 無此類融合的患者 ( n = 367, median survival: 94.6 month ) ( Figure 4a )；有 RhoGAP domain fusion 患者的遠端轉移發生率似乎較高 ( P = 0.15 ) 於沒有此融合的患者。其中 CLDN18-ARHGAP26 為出現率最高的 RhoGAP domain fusions ( 13 in 17 )，僅此 fusion 的有無即可獲得相似的預後狀態區分，突顯了 CLDN18-ARHGAP26 的 DGC 預後臨床關聯性 ( Figure 4b )。

Figure 4｜Clinical implications of RhoGAP domain-containing fusions in the expanded dataset (n = 384)
(a) Clinicopathological characteristics (gender and primary tumor location) and TCGA subgroups in patients with (upper row) and without (lower row) RhoGAP domain-containing fusions. (b) Kaplan-Meier curves for the overall survival of patients with DGCs expressing three recurrent RhoGAP domain-containing fusions (n = 17) and those without (n = 367). (c) Kaplan-Meier curves for the overall survival of patients with DGCs expressing the CLDN18-ARHGAP26 fusion (n = 13) and those without (n = 371)

4. SureSelect 抓出另一個復發性 fusion, TACC2-PPAPDC1A

為了盡可能找出 DGC 樣品中跟 25 個 in-frame fusions 有關的 RNA fusion 變異，以 SureSelect RNA Capture 技術，將參與 fusions 組成的 48 個基因的 exons 設計成 custom panel，進行 target RNA sequencing。此方式找到了與先前融合斷點 ( Table 1 ) 不同的新fusions ( Table 2 )，並多找出了三個預後關聯性高的 CLDN18-ARHGAP26 fusions，其中 2 個斷點也與之前不同。更重要的，這個方法鑑定出 TACC2-PPAPDC1A fusion 也具有復發性，佔了 DGC 腫瘤樣品的 1% ( 3 of 305 )，這是該 fusion 第一次在人類腫瘤樣品中報導其復發性。新發現的 TACC2-PPAPDC1A fusion 斷點與先前不同 ( Figure 6a )，並且未出現於周邊正常組織檢出，該 fusion 顯示出腫瘤特有的變異特色。

Table 1｜In-frame fusions in a discovery set (n = 80)

Table 2｜In-frame gene fusions additionally identified by targeted RNA sequencing analysis

Figure 6｜The PPAPDC1A in-frame fusions identified by targeted RNA sequencing
(a) Schematic representation of the PPAPDC1A fusions. Top and middle panels, TACC2-PPAPDC1A fusions; Bottom panel, ARIH1-PPAPDC1A. CC, Coiled-coil domain; PAP2, PAP2 domain; ZF, Zinc finger domain.

5. 復發性 fusions 的存在，比其他基因指標更能定義出預後最差的群體

根據該研究團隊的已知最大規模的瀰漫性胃癌 ( DGC ) 群體，復發性 fusions、PPAPDC1A 或 RhoGAP domain fusions 的存在，與預後最差群體有極顯著的關聯性，皆達到 p< 0.0001 ( Table 3 )。相較之下，以 SNP 晶片做的染色體不穩定性分析 ( chromosomal instability, CIN ) 或先前發現預後相關的 CDH1 突變，顯著程度都不如復發性 fusions。

Table 3 Cox regression survival analysis of 173 DGCs with available SNP6.0 array and DNA sequencing data

RNA fusion 為癌症研究新興且重要的 biomarker，瞭解它在癌症及生物機制上的角色也越來越重要。SureSelect RNA Capture Panel 可以設計出針對主題的客製化癌症 fusion 內容，讓您以高敏度方式，找出前人研究所遺漏的關鍵 RNA fusions，成為您未來癌症檢測開發或臨床應用上的重要技術。



【References】
1. Yang, H., Hong, D., Cho, S. Y., Park, Y. S., Ko, W. R., Kim, J. H., Hur, H., Lee, J., Kim, S. J., Kwon, S. Y., Lee, J. H., Park, D. Y., Song, K. S., Chang, H., Ryu, M. H., Cho, K. S., Kang, J. W., Kook, M. C., Thiessen, N., He, A., … Kim, H. K. (2018). RhoGAP domain-containing fusions and PPAPDC1A fusions are recurrent and prognostic in diffuse gastric cancer. Nature communications, 9(1), 4439.

2. Assumpção, P. P., Barra, W. F., Ishak, G., Coelho, L., Coimbra, F., Freitas, H. C., Dias-Neto, E., Camargo, M. C., & Szklo, M. (2020). The diffuse-type gastric cancer epidemiology enigma. BMC gastroenterology, 20(1), 223.

3. Cho, S. Y., Park, J. W., Liu, Y., Park, Y. S., Kim, J. H., Yang, H., Um, H., Ko, W. R., Lee, B. I., Kwon, S. Y., Ryu, S. W., Kwon, C. H., Park, D. Y., Lee, J. H., Lee, S. I., Song, K. S., Hur, H., Han, S. U., Chang, H., Kim, S. J., … Kim, H. K. (2017). Sporadic Early-Onset Diffuse Gastric Cancers Have High Frequency of Somatic CDH1 Alterations, but Low Frequency of Somatic RHOA Mutations Compared With Late-Onset Cancers. Gastroenterology, 153(2), 536–549.e26.