HRD 病患的腫瘤細胞其同源重組修復 ( Homologous Recombination Repair，簡稱 HRR ) 途徑失去功能，因此，同源重組缺失 ( Homologous Recombination Deficiency，以下簡稱 HRD )，可作為 PARP 抑制劑療效評估的生物標記。從 PAOLA-1[1] 第三期臨床試驗針對晚期卵巢癌分析，結果顯示 HRD 腫瘤患者受益於 PARP 抑制劑令癌莎 ( Olaparib ) 合併癌思停 ( Bevacizumab ) 的維持治療[2]。
由於 PARP 是 DNA 損傷修復的重要酵素，PARP 抑制劑可抑制參與修復受損 DNA 的酶，這些損傷有賴於 HRR 進行修復；在癌細胞中若 HRR 途徑失去功能，這些損傷就無法藉由同源 DNA 重組修復，進而造成 DNA 損傷累積，最終導致癌細胞死亡。
卵巢癌中 HRD 盛行率
大約 40-50% 的卵巢癌為 HRD 陽性，但根據 HRD 檢測方法和組織學亞型，其比例有所不同[3]。相比之下，BRCA 突變患者僅佔 HRD 患者的一半，這凸顯了在決定 PARP 抑制劑處方使用時，BRCA 突變結合 HRD 檢測的好處[4]。
HRD 檢測不限於卵巢癌
與 HR 途徑相關的 DNA 修復缺陷的檢測包含了乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌，這提供了這些癌種靶向 PARP 抑制劑療法的機會，而跨癌種的 HRD 檢測也在持續在優化中[5]。
HRD 檢測所包含的基因組訊息
HRD 檢測分成兩個部份，一為 BRCA 1/2 等 HRR 途徑的靶向捕獲基因套組的基因定序，以確認這些 HRR 途徑基因是否帶有致病變異，二為低覆蓋率的全基因組定序。這兩項檢測的結合是為了確定腫瘤細胞的同源重組功能是否發生缺失，其詳細特徵如下所述 ( 圖一 )。
基因組不穩定性 ( Genomic Instability，以下簡稱 GI )
HRD 通常包含兩個 GI 特徵，其為 HRR 途徑失去功能的後果。評估 GI 可藉由低覆蓋度的全基因組定序 ( shallow whole genome sequencing，以下簡稱 sWGS )，應使用至少 0.1X ~ 1X 進行定序覆蓋範圍，以獲得最佳效能。
GI 經由計算基因組長片段改變 ( Large Genomic Alteration，簡稱 LGA ) 和親源拷貝缺失 ( Loss of Parental Copy，簡稱 LPC ) 以進行評分。LGA 的定義為基因組中因發生長片段重組的斷點總數。在 GI 的計算中，發生重組的兩個基因組片段的長度至少為 10Mb，相距最多 3Mb；LPC 定義為至少 10Mb 長的單倍體片段的數量。
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| 【圖一】HRD 檢測的演算法概述：包含 GI 特徵 ( LPC，LGA ) 及 CCNE1 基因擴增，綜合這些檢測結果以計算腫瘤為 HRD 的機率。 |
拷貝數變異 ( Copy number variation，以下簡稱 CNV )
HRD 檢測尚考量 CCNE1 和 RAD51B 基因的拷貝數變異，其以 sWGS 結果進行計算。已知這兩個基因的拷貝數增加會促進同源重組效率及且對 PARP 抑制劑的治療反應較差[6],[7]。
BRCA1/2 基因的致病變異數量
HRD 檢測也應該考慮 BRCA1/2 基因致病和可能致病變異的數量，而這些致病及可能致病變異的判定，都應該遵循 ACMG 指南[8]。
Agilent HRR 靶向捕獲基因套組的臨床檢測
Agilent HRR 靶向捕獲基因套組[9]，包含 17 個基因 ( 表一 )，其中有 BRCA1/2 基因之外，尚設計 HRR 途徑和 DNA 修復相關基因及微星體不穩定位點，Agilent HRR 靶向捕獲基因套組是以雜交法捕獲這些基因的外顯子等區域進行定序，而 HRD 檢測是和法國 SeqOne 公司的雲端平台合作，將定序結果上傳至 SeqOne 雲平台，經由計算後提供 HRD 結果報告。
Agilent HRR 靶向捕獲基因套組的臨床評估
Agilent HRR 靶向捕獲基因套組的臨床檢測
Agilent HRR 靶向捕獲基因套組[9]，包含 17 個基因 ( 表一 )，其中有 BRCA1/2 基因之外，尚設計 HRR 途徑和 DNA 修復相關基因及微星體不穩定位點，Agilent HRR 靶向捕獲基因套組是以雜交法捕獲這些基因的外顯子等區域進行定序，而 HRD 檢測是和法國 SeqOne 公司的雲端平台合作，將定序結果上傳至 SeqOne 雲平台，經由計算後提供 HRD 結果報告。
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| 【表一】Agilent HRR 靶向捕獲基因套組所設計捕獲的 17 個基因及微星體不穩定 ( Microsatellite Instability ) 位點。 |
Agilent HRR 靶向捕獲基因套組的臨床評估
由於 PAOLA-1 臨床試驗的 HRD 檢測是採用 Myriad My Choice® CDx，因此透過來自 PAOLA-1 第三期臨床試驗的 368 例卵巢癌的回朔性分析實驗，並和 Myriad My Choice® CDx 的結果平行比對，主要三個結果如下：
1. 與 Myriad My Choice 的結果高度一致
1. 與 Myriad My Choice 的結果高度一致
MyChoice® CDx 檢測與 Agilent+SeqOne HRD 平台之間的一致性超過 90% ( 表二 )，在 338 位同時進行 MyChoice® CDx HRD 及 Agilent HRR 檢測的患者中 315 位的 HRD 結果一致。
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| 【表二】比較 MyChoice® CDx 檢測與 Agilent+SeqOne HRD 檢測結果，其中一致陰性有 135 例、一致陽性共 180 例，結果一致共 315 例。 |
2. Agilent+SeqOne Platform HRD 的無法得到結論性結果的案例較少
Agilent+SeqOne 平台 HRD 的結果不確定率 ( 表二 ) 較低 ( 1% )，而 Myriad My Choice® CDx 檢測達 7%，這可能是 Agilent+SeqOne 可以檢測腫瘤細胞含量較低的樣本 ( 測試實驗及結果後述 )。
3. 針對 Myriad 檢測結果沒有定論的樣品進行分析
針對 Myriad myChoice® CDx 檢測沒有定論，且接受令癌莎的 18 名病患腫瘤樣本進行了存活率分析，Agilent+SeqOne HRD 的檢測結果其中 14 名病患為 HRD 陰性、4 名為 HRD 陽性；而 HRD 陽性及 HRD 陰性存活曲線有明顯的差異 ( 圖二 ) ，這顯示 Agilent+SeqOne HRD 檢測可成功檢測 Myriad myChoice® CDx 結果不確定的檢體並提供預後資訊 ( HR=0.12，95% C.I.=0.01-0.95 )。於 14 名 HRD 陰性患者，皆在 40 個月內復發；相比之下，在 4 名 HRD 陽性患者中，只有一名患者在 40 個月內復發。這些臨床評估結果在 ESMO GYNAE 發表 ( 巴塞隆納，2023年2月24日 )[10]，摘要和投影片可在 ESMO 網站上取得。
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| 【圖二】18 名接受令癌莎治療而 Myriad 檢測不確定結果患者的 Kaplan Meier 曲線。Agilent+SeqOne HRD 陽性及陰性存活曲線呈現顯著差異證實 Agilent+SeqOne HRD 檢測可以補足 Myriad 檢測不確定結果且提供預後資訊 ( HR=0.12，95% C.I.=0.01-0.95 )。 |
Agilent+SeqOne HRD 檢測的技術評估
Agilent+SeqOne HRD 檢測同時也進行以下更多樣品的分析評估
1. 重複性分析
針對 47 人進行 BRCA 變異的重複性檢測。確認這 47 個樣本的 BRCA 變異檢測結果全部可重複。
2. 使用兩種不同定序儀進行再現性實驗
分別在兩個不同的實驗室進行 llumina NextSeq 和 NovaSeq 的定序分析，一致性為 95.7% ( 90/94 )。
3. 藉由稀釋實驗以檢查低腫瘤細胞占比對結果的影響
選取 4 個 HRD 陽性、且腫瘤細胞占比 >50% 的腫瘤樣品進行稀釋實驗，這些腫瘤 DNA 分別以對應患者的正常組織 DNA 進行系列稀釋，系列稀釋的 DNA 經由 HRD 檢測後進行分析結果是否仍然呈現陽性，比對結果顯示 Agilent+SeqOne HRD 檢測腫瘤細胞占比最低容許量為 20%。
各個 HRD 檢測平台的比較
如何進行 Agilent+SeqOne HRD 的臨床診斷
1. 樣品 QC
腫瘤細胞占比應大於 20%
2. HRD 檢測的文庫製備及定序
Agilent HRR 靶向捕獲基因套組採用 DNA 雜交法以捕獲標的 17 個基因相關區域進行定序 ( 圖三 )，步驟包含 DNA fragmentation、End Repair/A-tailing、Adaptor ligation、Clean-up、PCR sample-indexing 以建立初始文庫、Clean-up、Hybrid-capture、Wash and PCR 以擴增 HRD 捕獲文庫、QC，其中初始文庫及 HRD 捕獲文庫 DNA 留為定序分析；整個流程，可以手動操作，也可以視需要導入自動化機台 - Magnis[11]。
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| 【圖三】HRD 檢測的流程，包含文庫製備和 QC，整體流程需時約 9 小時，用戶可決定以手動操作，或導入自動化機台 Magnis。 |
3. 定序規格及 QC
( i ) 2X150 bp，以 Illumina Nextseq Mid Output flowcell 分析為例 ( 表三 )，Agilent HRR 靶向捕獲基因套組 + sWGS 文庫合併上機，一片 flowcell 可以分析 8 個樣品
( ii ) onTarget% 應高於 50%
( iii ) Agilent HRR 靶向捕獲基因套組基因組的涵蓋倍率應大於 1000X，定序量 ~1 Gb，( UMI 去除前的覆蓋率應大於 1000X，或去除後 UMI 的覆蓋率應大於 200x )
( iv ) sWGS 所需的最低覆蓋度是 0.1X，建議覆蓋率至少為 1X，定序量 ~3.5 Gb，以獲得最佳效能
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| 【表三】以 NextSeq Mid Output flowcell 為例建議的上機樣品量。如果 Agilent HRR 靶向捕獲基因套組 + sWGS 文庫合併上機，一片 Mid Output flowcell 可以分析 8 個樣品，若 HRR 靶向捕獲基因套組 + sWGS 文庫分開上機，只上機 Agilent HRR 靶向捕獲基因套組文庫可以分析 32 個樣品，只上機 sWGS 文庫可以分析 10 個樣品。 |
HRD 檢測流程安排
HRD 檢測流程考量報告時間限制及成本效益兩個因素，可規劃兩個流程 - 分別為快速流程及經濟流程 ( 圖四 )。快速流程即為 HRR 基因捕獲和 sWGS 平行進行分析，是省時的方法；經濟流程是先進行 HRR 基因捕獲定序以確定 BRCA 突變狀況，若 BRCA 未突變再進行全基因組定序，不失為一經濟有效的方法。
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| 【圖四】實驗室可以使用兩種不同的排程來進行 HRD 檢測。 |
【參考資料】
1. https://clinicaltrials.gov/study/NCT02477644
2. Ray-Coquard et al. (2019). Olaparib plus bevacizumab as first-line maintenance in ovarian cancer. New England Journal of Medicine, 381(25), 2416-2428.
3. da Cunha Colombo Bonadio, R. R., Fogace, R. N., Miranda, V. C., & Diz, M. D. P. E. (2018). Homologous recombination efficiency in ovarian cancer: a review of its epidemiology and management. Clinics, 73.
4. Weichert et al. (2022). Assessing homologous recombination deficiency (HRD) in ovarian cancer: Optimizing concordance of the regulatory-approved companion diagnostic and a next-generation sequencing (NGS) assay kit
5. Pacheco-Barcia et al. (2022). The Homologous Recombination Deficiency Scar in Advanced Cancer: Agnostic Targeting of Damaged DNA Repair. Cancers, 14(12), 2950.
6. Stronach E.A. et al. (2018). Biomarker Assessment of HR Deficiency, Tumor BRCA1/2 Mutations, and CCNE1 Copy Number in Ovarian Cancer: Associations with Clinical Outcome Following Platinum Monotherapy Biomarkers of Ovarian Cancer and Survival Outcome. Molecular Cancer Research, 16(7), 1103-1111
7. Bai, S., & Buckanovich, R. J. (2021). Therapeutic approaches for CCNE1-amplified HR-proficient ovarian cancer. Cancer Research, 81(13_Supplement), 2060-2060.
8. Richards, S., et al. (2015). Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in medicine, 17(5), 405-423.
9. SureSelect CD HRR17 - SureSelect HRR 靶向捕獲基因套組
10. Boidot, R., et al. (2023). Clinical evaluation of a low-coverage whole-genome test for homologous recombination deficiency detection in ovarian cancer. ESMO Open 8.1
11. Magnis NGS Prep System - Magnis NGS 樣品製備系統
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