ctDNA：大腸癌 MRD 檢測與治療決策的全新篇章

在癌症治療的過程中，手術後的「微量殘存疾病」（MRD）一直是一個挑戰。即使切除了肉眼可見的所有腫瘤，傳統的影像學檢查或血液檢測也無法完全偵測到殘存的癌細胞，這些細胞就像潛伏的火種，隨時可能復燃。
然而，循環腫瘤 DNA（ctDNA）的出現，為這個問題提供另一種高靈敏度及高特異性的偵測工具。ctDNA 是從血液中源自於腫瘤細胞的DNA片段，現在可以透過高靈敏度的液態活檢技術，可以在影像學檢查發現復發之前，精準地偵測到這些「分子級」的微量殘留。
ctDNA 的價值不僅在於其預測癌症復發的準確能力，目前的臨床試驗結果顯示它能夠做為治療決策的指引參考。這意味著，醫生可以根據 ctDNA 檢測的結果，為患者量身定制最個人化的治療方案。

一，MRD 的核心概念與重要性：從血癌到實體瘤

Minimal Residual Disease（MRD，微量殘留疾病）是指在癌症治療後，即使手術邊緣乾淨、影像無腫瘤跡象，病人雖然已經達到臨床上的完全緩解，但體內仍可能殘留極少量的癌細胞，這些細胞數量少到傳統的影像檢查或一般實驗室檢查偵測不到，但卻可能會造成日後復發或轉移，這些微量殘存的腫瘤細胞即為「MRD」。

MRD 的概念最早發展於血癌(圖一)如急性淋巴性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、多發性骨髓瘤（MM）及非何杰金氏淋巴瘤（NHL）等，因為這些癌症本身是「系統性」疾病，腫瘤細胞存在於血液或骨髓中，因此可以使用多色流式細胞儀（flow cytometry）、定量PCR(quantitative PCR，簡稱qPCR及數位PCR(digital PCR，簡稱dPCR)等高靈敏度技術來偵測微量腫瘤細胞，精準評估治療效果、預測復發。但近年 MRD 已成功擴展到實體瘤（solid tumors）。

圖一，MRD特別是在血癌治療後的追蹤過程及預測復發，Y軸為腫瘤細胞在血液中或骨髓中的占比，X 軸為從治療後的緩解到後續的疾病監控階段的時間，藍色線為復發個案，MRD呈現陽性，其初期治療有效，腫瘤細胞下降到肉眼檢測不到但仍有MRD，隨著時間進展，MRD 開始回升、先出現 MRD relapse（灰色區），之後達到 hematologic relapse（血液學復發，藍色區）；紅色線為未復發個案，MRD檢測結果為陰性，其腫瘤細胞下降後完全清除，MRD 陰性，無復發現象。(修改自Short et al., Am J Hematol. 2019 February ; 94(2): 257–265)¹

二，偵測 MRD 的原理與方法

隨著技術進步，MRD的偵測主要依賴高靈敏度檢測方法如次世代定序，或定量PCR來偵測癌症病患特有的DNA變異，考量每位癌症病患的基因變異不盡相同，如何設計偵測方法及對應基因套組為實體瘤MRD偵測的挑戰，目前已經進入臨床應用的偵測方法，依照其偵測方法及基因套組的設計，可分類病人特異性突變追蹤（Tumor-informed MRD）及腫瘤非依賴型（Tumor non-informed MRD）兩種(圖二)，介紹如下：

1. 方法一：病患特異性突變追蹤（Tumor informed MRD）
(1). 原理：

§ 首先對患者初始腫瘤樣本（手術切片或穿刺活檢）做全面的 NGS 定序，找出特異性的腫瘤細胞突變，如 TP53, KRAS, EGFR 等。
§ 利用這些特定突變，在病人血漿 cell free DNA(簡稱cfDNA）中進行NGS 深度定序。

(2). 特色：
精準、個人化設計，但需取得待檢病患腫瘤組織樣本，並以大型基因套組(例如全外顯子) 定序獲得待檢病患的基因組變異資訊，方可針對病患的腫瘤細胞突變進行客製化設計檢測。
(3). 代表技術與公司：
§ Signatera™（Natera）
§ RaDaR™（Inivata, 於2021年為NeoGenomics所併購）

2. 方法二：腫瘤非依賴型（Tumor non-informed MRD）
(1) 原理：

不需原始腫瘤樣本的基因變異資訊，直接純化病患血漿中的ct DNA，使用癌症相關基因檢測套組，或純化甲基化DNA進行深度定序，以偵測常見突變或甲基化異常。

(2) 優點：無需前測組織，檢測更快速。
(3) 代表技術與公司：Guardant Health 的 Reveal™ assay

圖二，MRD偵測方法分為病患特異性突變追蹤（Tumor-informed MRD）及腫瘤非依賴型（Tumor non-informed MRD）兩種，其中病患特異性突變追蹤需取得待檢病患腫瘤組織樣本，並以大型基因套組(例如全外顯子) 定序獲得待檢病患的基因組變異資訊，方可針對病患的腫瘤細胞突變進行客製化設計檢測，需時較長(>1個月)，但是特色為準、個人化設計；腫瘤非依賴型則不需要針對原始腫瘤樣本進行基因定序，直接純化病患血漿中的cf DNA，使用癌症相關基因套組，或純化甲基化DNA進行 ultra-deep sequencing，以偵測常見突變或甲基化異常(取自ASCO Daily News October 1, 2020)²

茲將以上兩種方法比較如下：

表一，MRD偵測方法的比較，分病患特異性突變追蹤（Tumor informed MRD）及腫瘤非依賴型（Tumor non-informed MRD）兩種。

^$意義未明的克隆造血 (Clonal Hematopoiesis of Indeterminate Significance，簡稱CHIP)

三，Guardant Reveal 檢測

  以上已經商業化應用的MRD偵測方法，多為偵測病患腫瘤特異的基因組的變異，只有Guardant Health研發的Reveal是檢測血液中的腫瘤特異甲基化DNA，其原理立基於已知許多科學研究顯示DNA甲基化與腫瘤發生有密切關聯：

1. DNA 甲基化的概念
  DNA 甲基化是指在 DNA 序列中的胞嘧啶（C）第 5 碳原子上加上甲基（CH₃）(圖三)，這樣的現象通常發生於CpG islands。
  甲基化不改變 DNA 序列，但會影響基因的表現，通常高度甲基化會抑制基因表現，而去甲基化會活化基因表現。

圖三，DNA 甲基化是指在 DNA 序列中的胞嘧啶（C）第 5 碳原子上加上甲基（CH₃，藍色圈起處）。

2. DNA 甲基化與腫瘤發生的兩個模式
(1) 高度甲基化（Hypermethylation）

抑癌基因（tumor suppressor genes）啟動子區高度甲基化造成基因被沉默(silencing)，意即基因不表現。常見例子：MLH1、BRCA1等和DNA修復功能相關的基因，若其啟動子區高度甲基化，結果造成DNA 修復能力下降、細胞失控增殖，進而促進腫瘤形成。

(2) 低甲基化（Global hypomethylation）

基因組多處去甲基化，尤其在致癌基因（oncogenes）的啟動子區域，而致使表現被提升。

3. Reveal 檢測的原理
基於上述已知科學基礎，Guardant欲建立腫瘤特異性甲基化區域資料庫以應用於ctDNA檢測MRD，其做法收集超過 5,000 份來自不同癌症類型（乳癌、肺癌、結直腸癌與膀胱癌）患者及無癌捐贈者的血液樣本作為訓練數據集(training set)，以開發並優化腫瘤特異性甲基化區域(Differentially Methylated Region)資料庫，這個資料庫能幫助識別與癌症相關的甲基化DNA，並將其與健康個體的正常甲基化DNA加以區分(圖四)。

圖四，Guardant收集超過 5,000 份來自不同癌症類型（乳癌、肺癌、結直腸癌與膀胱癌）患者及無癌捐贈者的血液樣本作為訓練數據集(training set)，開發並腫瘤特異性甲基化區域(Informative Differentially Methylated Region，紅色框起處)資料庫，將其與無癌個體的正常甲基化區域(Uninformative Differentially Methylated Region，黑色框起處)加以區分。

於檢測方法學，Guardant亦利用抗5-methylcytosine抗體以捕獲甲基化的DNA片段，以次世代定序分析其DNA序列，再比對建置的腫瘤特異性甲基化區域資料庫，若和其腫瘤特異性甲基化區域吻合，顯示待檢病患的血漿cfDNA有腫瘤特異性甲基化區域，顯示這些甲基化DNA是源自於腫瘤細胞(圖五)。

圖五，Guardant Reveal檢測利用免疫沉澱法純化甲基化DNA 以定序分析(Methylated DNA Immunoprecipitation，簡稱MeDIP)。腫瘤細胞釋放其DNA至血液中，包含腫瘤特異性甲基化DNA，因此可利用抗5-甲基胞嘧啶) 5-methylcytosine ，5meC) 抗體特異性地結合 5-甲基胞嘧啶，將甲基化 DNA 片段從整體基因組 DNA 中富集出來，再以次世代定序分析腫瘤特異性甲基化區域序列。

4. 臨床應用潛力
Guardant Reveal 是第一個完全不依賴腫瘤組織的MRD 檢測，其 tissue‑free 特性可減少組織取得與處理困難，並縮短決策等待時間。

四，大腸癌臨床試驗：ctDNA從預測到治療方案的指引
目前Guardant Reveal在實體瘤的應用，在大腸癌、乳癌及肺癌都有相當多的臨床試驗在進行中，其中以大腸癌的應用最為廣泛：

1. COSMOS‑CRC‑01 研究³- ctDNA可做為術後復發監測的評估

Guardant Reveal 的 COSMOS‑CRC‑01（全名：COnquer Solid Malignancies by blOod Screening CRC‑01）試驗，是一項由日本主導的多中心、前瞻性、非隨機觀察性研究，專門評估 Guardant Reveal基於甲基化的 ctDNA MRD檢測平台在晚期結直腸癌（Stage I–III）術後復發監測的表現。(1). 參與者與樣本收集

§ 招募時間：2020 年 1 月至 2021 年 4 月

§ 結直腸癌臨床分期：Stage I–III（接受 R0及R1 根治性切除手術者）

§ 共納入 338 名患者（共採集1977血液樣品），分三組：

- 縱向監測組（Longitudinal Surveillance）：納入條件為術後有 ≥2 個血液樣本可用，納入人數/樣本：334 位患者，共 1,902 個樣本。
   目的為追蹤 ctDNA 動態變化來分析復發風險 (RFI, recurrence-free interval)，並計算 ctDNA的靈敏度、特異性、lead time。
- 術後第28天組（28-Day Post-Surgery），納入條件為術後約 4 週（尚未接受輔助治療）採血，且為 Stage II 以上患者，納入人數/樣本：216 位患者，216 個樣本。
   目的：分析術後第28天 ctDNA 檢測結果與復發風險的相關性。
- 術後化療組（Post-Chemotherapy）：納入條件為Stage II 以上，有化療前後成對樣本，納入人數/樣本：112 位患者，224 個樣本。
   目的：分析化療後 ctDNA 狀態與復發風險 (RFI)，檢驗 ctDNA 清除狀態。

表二，A圖為COSMOS-CRC-01臨床試驗的設計，分三組，分別為：1. Longitudinal Surveillance（縱向監測組），條件：術後有 ≥2 個血液樣本可用，人數/樣本：334 位患者，共 1,902 個樣本；2. 28-Day Post-Surgery（術後第28天組），納入條件：Stage II 以上患者，術後約 4 週，接受輔助治療之前採血，人數/樣本：216 位患者，216 個樣本；3. Post-Chemotherapy（術後化療組），納入條件：Stage II 以上患者，有化療前後成對樣本，人數/樣本：112 位患者，224 個樣本。

B圖為縱向監測的採檢設計，主要目的是透過多次 ctDNA 檢測，持續追蹤患者術後是否有MRD，以便提早偵測復發風險。其進行方式術後第28 天進行初始治療後的首次採檢；在治療後的第一年，監測頻率較高，每三個月進行一次採檢；在隨後第2 至第5 年，監測頻率降低為每六個月一次，分析結果與臨床影像追蹤比對（每 6 個月以 CT 或 MRI檢測）。

2. 檢測方法與技術平台
  利用 Guardant Reveal 平台，從術後血漿中萃取 cfDNA，基於甲基化DNA進行片段分離、NGS定序，分析約 CRC 特異性差異甲基化區域，並判定 ctDNA 檢出或未檢出，最後估算 tumor fraction 。臨床試驗結果呈現以下特點：
§ 試驗操作完成與報告期間短（樣本送達後約 7–10 天內完成結果）
§ 結果顯示ctDNA檢出和復發與否呈現高度相關(圖五，A~C)
   - 特異性：從縱向監測組中的術後經治療後無復發的290患者1,461樣品分析，特異性為98.2%（95% CI：97.3–98.9%）。
   - Lead Time（檢出時間優勢）：中位數 lead time 約 5.3 個月（IQR：3.0–16.4 月），最大值為28.7個月，即 ctDNA 檢出通常比影像復發提前5.3個月(圖五，D)。
   - 檢出率：在 41 位第 II 期或更高分期並發生復發的患者中，透過縱向多次採樣並依癌種（結腸癌或直腸癌）進行分析，結果顯示多次採樣能提升復發檢測的敏感性((圖五，D)：結腸癌為 81%（17/21，95% CI：58.1%–94.6%），直腸癌為 60%（12/20，95% CI：36.1%–80.9%）。
§ Guardant Reveal臨床應用潛力
   - 為第一個完全不需腫瘤組織基因檢測結果的 CRC MRD 檢測，其tissue‑free 特性可縮短決策等待時間，減少組織取得與處理困難。
   - MRD 檢出與否與復發風險密切相關，縱向多次採檢 ctDNA 可提高復發風險預測敏感度，為治療反應與復發預測提供實用依據。

圖六，COSMOS-CRC-01研究結果。

A~C圖，分別為術後第28天組單點採樣(A)、縱向監測多點採樣(B)、術後化療前後比較組之ctDNA檢出和RFI之Kaplan–Meier 分析圖。

D圖，影像學方法確認復發前檢出 ctDNA 的 23 個樣本中，中位提前時間（lead time）為 5.3 個月（IQR：3.0–16.4 個月），最長可提前至 28.7 個月。

E圖，縱向監測期間， 41 位第 II 期或更高分期且發生復發的患者中，依患者為結腸癌或直腸癌進行分析，以累積ctDNA 檢出率評估敏感性，顯示術後 ≥2 個時間點的採檢，有助於提升檢出率。

3. PEGASUS 臨床試驗-以ctDNA 檢測結果做為化療方案的指導

(1) 全名／註冊號碼：PEGASUS Study（NCT04259944），為一項在義大利與西班牙執行的前瞻性、多中心臨床研究，以ctDNA 檢測結果做為指導治療方案，旨在降低大腸癌化療不必要毒性，並對高風險患者提供更積極的治療。
(2) 納入條件：高風險 Stage II或 Stage III大腸癌患者，共計約 140 名患者
(3) 採樣與監測時間點：術後血液多點採樣，用 Guardant Reveal 測試 MRD 狀態，再根據結果調整輔助化療(圖六)，即以ctDNA偵測結果指導治療方案，旨在降低正常耐受者的不必要毒性，並對高風險患者提供更積極的治療。

· 術後 ctDNA 陽性（MRD‑positive）：初步採用 standard CAPOX（3 個月）；若仍陽性→升階治療為 FOLFIRI
· 術後 ctDNA 陰性（MRD‑negative）：降階採毒性較低的 CAPE 單藥治療（6 個月)

圖七，PEGASUS臨床試驗以ctDNA 指導治療。納入約 140高風險 Stage II或 Stage III大腸癌患者，術後檢測 ctDNA 陽性（MRD‑positive）者，初步採用 standard CAPOX（3 個月），若仍呈陽性→升階治療為 FOLFIRI（folinic acid–fluorouracil–irinotecan；術後檢測 ctDNA 陰性（MRD‑negative）者，降階採低毒性的 CAPE 單藥治療（6 個月）。

2023結果重點（源自 ESMO 2023 LBA28 發表)4

§ ctDNA 檢出率：

· 術後 35/135（26%）為ctDNA陽性；其中 12 人（34%）復發。
· 術後 100/135 為 ctDNA陰性；其中 9 人（9%）復發。

以上結果顯示ctDNA陽性與復發高度相關(HR = 4.37，log-rank P = 0.0003)。

2025結果重點（源自 ESMO 2025 發表)⁵
§ 可行性 (Feasibility)：定義為連續兩次術後 ctDNA 陰性患者的兩年無疾病生存率 (DFS)，試驗結果(圖八)顯示 ctDNA 陰性組中，兩年 DFS 率為 88%。雖然略微錯過了預設的 92% 門檻，但該表現仍超過 85% 的基準，支持 ctDNA 引導的策略是可行且具實用性的。

* 預後價值 (Prognostic Value)：

- ctDNA 陰性組 (MRD陰性)：兩年 DFS 率為 85.9%（100 名患者中僅 12 人復發）。
- ctDNA 陽性組 (MRD陽性)：兩年 DFS 率為 61.8%（35 名患者中 13 人復發）。

§ 結論： ctDNA 陽性患者的復發風險明顯更高（風險比 HR 為 2.71），再次證實了 ctDNA 作為早期預測復發的強大預後價值。總體生存期 (Overall Survival, OS)： ctDNA 陰性患者的總體生存期也較好（HR 3.11），與 DFS 趨勢一致。

§意義：PEGASUS 試驗證明了在已切除的第三期和高風險第二期結腸癌中，MRD引導的輔助治療具有可行性和臨床應用前景；透過根據患者的MRD結果來調整治療的時長和強度（升階或降階），有望減少不必要的治療毒性，並優化術後追蹤策略。

圖八，PEGASUS 臨床試驗結果。左圖為DFS，藍線為術後血液中末檢測到 ctDNA的患者群體，紅線為術後血液中仍檢測到ctDNA的患者群體，顯示ctDNA+患者的預後明顯較差，復發風險更高；關鍵數據點在24 個月DFS： ctDNA-組為 85.9、ctDNA+組為 61.8%，風險比 HR = 2.71（CI: 1.35-5.45）； Log-rank P=0.0036$，遠小於 0.05，表示兩組之間的DFS差異具有極顯著的統計學意義。右圖為OS，顯示ctDNA陽性患者的死亡風險更高，關鍵數據點於42 個月OS，ctDNA陰性組為 93.8%、ctDNA陽性組為 79.7%，風險比HR = 3.11$；Log-rank P}=0.0383，顯示兩組之間的OS差異具有統計學意義。