NGS 精準醫學檢測中，RNA 一直是非常挑戰的樣品類型。相較於 DNA 的穩定度，即便是良好保存的新鮮組織，RNA 也都會出現降解現象，更不用說是 FFPE 組織。RNA 降解會對許多層面有非常大的影響，例如核酸抽取產率、選用的文庫方法學、突變檢測有效性、突變檢測靈敏度等。因此如何在臨床日常流程下，針對相關環節加強，獲得足量、一定完整度的 RNA 樣品來進行定序，尤其面對的是臨床 FFPE 組織，是一個重要的課題。藉由 JSP 的一系列測試，了解 FFPE 處理流程對 RNA 品質的影響以及後續定序結果的效應，並由此建立一套 RNA QC 標準以及最適化的樣品處理方法，確保合理的定序結果，保障病理研究或輔助診斷的價值。
【圖一】臨床樣品處理概要流程
為了維持 FFPE-RNA 的質與量，如果能夠在萃取核酸前恰當的進行取樣與 FFPE 處理，會是有效幫助 RNA 維持其完整性、高品質的關鍵之一。上一篇說明 FFPE 樣品欲抽取 DNA 的前端處理，本篇將延續介紹 RNA 部分，在核酸萃取前該如何取樣、以及對其進行 FFPE 處理的最佳方法。
根據日本病理學會 ( The Japanese Society of Pathology, 簡稱 JSP ) 對於臨床 RNA 樣品定序前處理之建議：
( 1 ) 取樣
與 FFPE-DNA 樣品的取樣方式相同，手術切除組織後，要盡快固定樣本，1小時內進行固定，切勿超過3小時，等待固定過程需存於 4℃，不可置於室溫下超過30分鐘。
另外，使用內視鏡取樣或活組織切片收集的樣本，需要立即浸入固定劑中並固定。
( 2 ) FFPE 處理
固定：
固定不當 ( 固定不足或過度固定 ) 會導致核酸品質下降，也是 FFPE 處理的第一步。固定步驟的影響因素包含固定液的種類、濃度、pH，固定時間、溫度，固定時的試劑/組織之間的比例，以及固定液的滲透方式。為了獲得最佳品質的 FFPE-RNA，針對以上各種條件進行測試，並使用 Agilent TapeStation 系統分析最終萃取出來的 RNA 品質，以該系統計算得出 RIN value ( 如圖 ) 作為評估標準，數值越高，則核酸完整度越高、降解程度越低、品質越好。
與 DNA 固定條件不同，處理欲萃取 RNA 的樣本時，JSP 建議使用 15% 或 20% NBF、在室溫固定 3 – 7 days，可以回收較高品質 ( RIN value 較高 ) 的 RNA。
儲存：
FFPE 樣品可允許存放室溫陰涼處，如要更長期保存、或進行 NGS 實驗之用，建議存於 4℃，採取 4℃ 低溫儲存可以防止核酸劣化，並且每一次樣品準備需要重新切片，避免使用已切片一段時間的樣本。
硬組織樣品固定時間不宜過長，固定後以 EDTA 脫鈣再長期儲存之，可留存較好的核酸品質。
( 3 ) 核酸萃取
日本病理學會《基因組醫學病理組織標本處理規定》對於定序樣品前處理之建議：
唯有具備高品質的樣品，才可擁有高品質數據。參考 JSP 的建議，最適化調整 FFPE 樣品處理方法，並標準化建立一套臨床樣品處理的 SOP，可以大大幫助 NGS 技術從科研領域邁向臨床應用。
【參考資料】
- Yae Kanai. (2018) The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International, 68 (2) 63-90.
- 日本病理學會：https://pathology.or.jp/
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