日本病理學會NGS QC標準化系列 - FFPE 樣品選擇與定序靈敏度

在前幾篇的介紹中大家可以感受到日本病理學會 The Japanese Society of Pathology, 簡稱 JSP ) 試著在臨床可行的組織擷取以及 FFPE 處理流程下,讓組織內的 DNA / RNA 保有基因檢測的可行性。而此篇是關於 JSP 對樣品的可判讀度、可用度、與定序靈敏度的建議介紹使用何種 FFPE 切片紀錄下甚麼資訊如何評估其 DNA / RNA 可實驗性搭配適當的 VAF 靈敏度定序以獲得真正有判讀價值的基因定序結果。

【圖一臨床樣品處理流程


日本病理學會 ( JSP ) 對 FFPE 樣品選擇及核酸萃取建議:

切片、選樣:

每一次核酸萃取前再切新的 FFPE 切片來用,要戴手套執行以避免核酸降解。選樣部分 ( 如圖二 ),若進行腫瘤細胞基因檢測,建議要做 HE 染色並大略紀錄組織腫瘤比率SNV 分析需要 > 30% 腫瘤比CNV 分析需要 > 50% 的腫瘤比。腫瘤比率太低者需事先移除非腫瘤部分,以拉高突變存在比例 VAF, Variation Allele Frequency )。另外,後續基因定序時,定序倍率要能達到 VAF 5-10% 偵測率。



【圖二基因診斷用的 HE 染色標本範例 ( A ) 藍線:腫瘤細胞擴散區域。黃線基因檢測取樣範圍。綠線:需要切除的區域。( B ) 避免使用,儘管有腫瘤細胞但嗜中性球 ( neutrophil ) 很多。( C ) 避免使用,多為非腫瘤細胞,如:漿細胞 ( plasma cell ) 和肌肉層 ( muscle layer ),腫瘤細胞比例低。


萃取:

核酸萃取建議選擇臨床樣品適用的試劑,萃取後必須進行核酸品質鑑定 ( QC ) 確認純度與總量,以評估樣品是否合適進行後續定序實驗。測定方法包含:

Nanodrop A260/A280 + Qubit dsDNA最簡單方便的方法,可估計核酸純度與產率,但對於品質的準確度較低。

  • DNA測定要求:A260/A280 : 1.7-1.9
  • RNA測定要求:A260/A280 : 1.9-2.1

微流體電泳法:Agilent QC 系統 ( TapeStation ( DIN + Dv200 ) 2100 Bioanalyzer ( DV200 ) ),數位化結果以評估核酸完整度,快速、不汙染,合適臨床應用。

qPCR / RT-qPCR 法:使用兩個不同長度的擴增子的 Ct 差異來評估反應性,依後續應用需求有不同的 primer 設計及評估做法。


【日本病理學會《基因組醫學病理組織標本處理規定》對於定序樣品處理之建議】


透過 JSP《基因組醫學病理組織標本處理規定》,了解到為將 NGS 納入臨床常規應用,日本醫界建議了:

( 1 ) 標準化 Biopsy / FFPE 固定流程

找出醫療院所可行的標準步驟,於採檢 保存時維持檢體的 DNA / RNA 品質。

( 2 ) 標準化選樣與抽取

獲得知道比例、有判讀性、合適品質、足量的 FFPE - DNA / RNA 樣品

( 3 ) 標準化樣品 QC 準則

以簡易指標評估樣品可用性另外標準化還代表了日常可行性考量臨床場域的人力、操作、時間、維護、方便性等。

( 4 ) 有判讀效力的定序規格

在一定的腫瘤占比下搭配 5-10% VAF 靈敏度定序規格取得有效力的定序數據。


在臨床 NGS QC 標準化下,Agilent TapeStation 系統最貼近臨床樣品 QC 需求,具有不汙染、快速分析、數據化結果方便 QC 判讀標準化。有了 Agilent TapeStation QC 系統的協助,標準化的臨床 NGS 樣品 QC 即能十分輕鬆。基於良好的樣品處理與品質,就能取得有效力的定序結果,此刻 NGS 才真的進入臨床,開啟精準醫學應用。

【圖三】Agilent TapeStation 幫助 NGS 臨床實用化


【參考資料】
  1. Yae Kanai. (2018) The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International, 68 (2) 63-90. 
  2. 日本病理學會:https://pathology.or.jp/

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