RNA fusion 實驗演進 ( 下 ) - 舊把戲新玩法 RNA-capture NGS 與臨床實例


NGS 進行 RNA 分析起初以基因表現 ( gene expression ) 為主,隨著近來定序通量快速增加後,大型癌症基因體計畫也將 fusion RNA 找尋列入定序項目 ( 詳細介紹:https://welgene.blogspot.com/2021/11/rna-fusion.html )。相對於大型基因體計畫,主題式癌症研究或精準醫學則聚焦於 kinase RNA fusion 分析,利用 targeted RNA Sequencing 加強 kinome 基因的定序深度。相比之下,targeted sequencing ( Capture Seq, 99224 ) 增加約為傳統 RNA 定序 ( RNA-Seq, 340 ) 的 290 倍 1 ( 圖一 ),關注特定 transcript 增加靈敏度及降低成本,有助發現更深入而完整的 RNA fusion 訊息 ( 圖二 )

根據目前的技術,fusion RNA 定序透過 amplicon-based PCR 法、anchored multiplex PCR ( AMP )、hybrid capture 法來製備樣品,雖然 PCR 法允許 RNA 樣品需求量較低,但 PCR 偏好現象會影響 RNA library 製備的完整性。AMP 使用界於 exon-intron 的 primer,策略性地擴增 exon 或 intron 中可能發生 fusion 的基因區域,但還需考慮 PCR-bias 問題。而 RNA capture 可避開 PCR-bias,較均勻的捕抓目標片段,較能完整保留、不遺漏重要的基因訊息,是現今解析細微 RNA fusion 合適的工具 2 ( 圖三 )

【圖一】Novel RNA fusion detection by targeted RNA-Seq ( Capture Seq ).

【圖二】Targeted RNA-Seq offers highly robust fusion detection compared to whole transcriptome and mRNA-Seq methods.

【圖三】Three NGS targeted approaches available for RNA fusion analysis.

Capture based target enrichment 配合定序技術在 RNA fusion 研究漸漸穩定成熟,近來蓬勃發展至疾病分子診斷的使用上。韓國於 2017 年開始研擬健保系統的癌症基因檢測,以首爾大學附設醫院為例,陸續開發了數種 solid tumor Oncopanel 設計。其中 fusion RNA 檢測也在開發之列,開發時測試了三種不同的 fusion gene 抓取法,以測試臨床適用性 3


為了臨床檢測使用的正確率,使用 AMP 所需的 RNA 樣品品質要求至少 DV200 ≧ 50% ( 圖四 ),大幅增加臨床取樣、準備的困難度;Hybrid-capture 使用 DV200 ≧ 30% ( 圖四 ) 的 RNA,可在高靈敏度下,準確檢出 fusion gene,不遺漏任何基因訊息 ( 圖五 )

【圖四】RNA requirement for Anchored multiplex PCR based ( AMP ) and Hybrid-capture based ( SureSelect ) RNA-Seq.

【圖五】Anchored multiplex PCR based ( AMP ) and Hybrid-capture based ( SureSelect ) RNA-Seq detection.

Targeted RNA-Seq 作為臨床設計疾病特定 fusion 基因檢測,在分子診斷中越顯重要,需要一個靈敏度高、臨床樣品適用、準確性的實驗方法,Agilent SureSelect 系統基於 capture 技術,並具備樣品需求最佳化與高度自動化特性,是一套整合臨床需求的 RNA 檢測平台 ( 圖六 ),為基因醫學帶來更多的研究價值,以期未來可以真正實用於精準醫療之中。


【圖六】Fully automated RNA library-prep for clinical / research use.

【圖七】SureSelect FFPE RNA input optimized for targeted RNA-Seq.

2005-2006 的 NGS 興起,更是以極高效率做更多的癌種、病人樣品、全基因掃描融合基因的存在。NGS 除了鑑定出更多的融合基因外, 也因其高通量取樣定序能力,以及基因捕抓技術的配合,始得常規化的 RNA 臨床研究 / 診斷成為可能。



【參考資料】
1. https://www.nature.com/articles/nbt.2024
2. https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14737159.2021.1920399
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7460167/

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