NGS 進行 RNA 分析起初以基因表現 ( gene expression ) 為主,隨著近來定序通量快速增加後,大型癌症基因體計畫也將 fusion RNA 找尋列入定序項目 ( 詳細介紹:https://welgene.blogspot.com/2021/11/rna-fusion.html )。相對於大型基因體計畫,主題式癌症研究或精準醫學則聚焦於 kinase RNA fusion 分析,利用 targeted RNA Sequencing 加強 kinome 基因的定序深度。相比之下,targeted sequencing ( Capture Seq, 99224 ) 增加約為傳統 RNA 定序 ( RNA-Seq, 340 ) 的 290 倍 1 ( 圖一 ),關注特定 transcript 增加靈敏度及降低成本,有助發現更深入而完整的 RNA fusion 訊息 ( 圖二 )。
根據目前的技術,fusion RNA 定序透過 amplicon-based PCR 法、anchored multiplex PCR ( AMP )、hybrid capture 法來製備樣品,雖然 PCR 法允許 RNA 樣品需求量較低,但 PCR 偏好現象會影響 RNA library 製備的完整性。AMP 使用界於 exon-intron 的 primer,策略性地擴增 exon 或 intron 中可能發生 fusion 的基因區域,但還需考慮 PCR-bias 問題。而 RNA capture 可避開 PCR-bias,較均勻的捕抓目標片段,較能完整保留、不遺漏重要的基因訊息,是現今解析細微 RNA fusion 合適的工具 2 ( 圖三 )。
【圖一】Novel RNA fusion detection by targeted RNA-Seq ( Capture Seq ). |
【圖二】Targeted RNA-Seq offers highly robust fusion detection compared to whole transcriptome and mRNA-Seq methods. |
【圖三】Three NGS targeted approaches available for RNA fusion analysis. |
Capture based target enrichment 配合定序技術在 RNA fusion 研究漸漸穩定成熟,近來蓬勃發展至疾病分子診斷的使用上。韓國於 2017 年開始研擬健保系統的癌症基因檢測,以首爾大學附設醫院為例,陸續開發了數種 solid tumor Oncopanel 設計。其中 fusion RNA 檢測也在開發之列,開發時測試了三種不同的 fusion gene 抓取法,以測試臨床適用性 3 :
為了臨床檢測使用的正確率,使用 AMP 所需的 RNA 樣品品質要求至少 DV200 ≧ 50% ( 圖四 ),大幅增加臨床取樣、準備的困難度;Hybrid-capture 使用 DV200 ≧ 30% ( 圖四 ) 的 RNA,可在高靈敏度下,準確檢出 fusion gene,不遺漏任何基因訊息 ( 圖五 )。
【圖四】RNA requirement for Anchored multiplex PCR based ( AMP ) and Hybrid-capture based ( SureSelect ) RNA-Seq. |
【圖五】Anchored multiplex PCR based ( AMP ) and Hybrid-capture based ( SureSelect ) RNA-Seq detection. |
Targeted RNA-Seq 作為臨床設計疾病特定 fusion 基因檢測,在分子診斷中越顯重要,需要一個靈敏度高、臨床樣品適用、準確性的實驗方法,Agilent SureSelect 系統基於 capture 技術,並具備樣品需求最佳化與高度自動化特性,是一套整合臨床需求的 RNA 檢測平台 ( 圖六 ),為基因醫學帶來更多的研究價值,以期未來可以真正實用於精準醫療之中。
【圖六】Fully automated RNA library-prep for clinical / research use. |
【圖七】SureSelect FFPE RNA input optimized for targeted RNA-Seq. |
2005-2006 的 NGS 興起,更是以極高效率做更多的癌種、病人樣品、全基因掃描融合基因的存在。NGS 除了鑑定出更多的融合基因外, 也因其高通量取樣定序能力,以及基因捕抓技術的配合,始得常規化的 RNA 臨床研究 / 診斷成為可能。
【參考資料】
1. https://www.nature.com/articles/nbt.2024
2. https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14737159.2021.1920399
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7460167/
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