Lymphocytes ( 淋巴球 ) 為 T 細胞、B 細胞、NK 細胞 ( 自然殺手細胞 ) 等不同作用的白血球所組成，其惡性病變稱為惡性淋巴瘤 ( malignant lymphoma )。惡性淋巴瘤分為 Hodgkin Lymphoma ( 何杰金氏淋巴瘤, HL ) 和 Non-Hodgkin Lymphoma ( 非何杰金氏淋巴瘤, NHL ) 兩種。Hodgkin Lymphoma 源於 mature B-cell ( 成熟 B 細胞 ) 惡化而來的 Reed-Sternberg cells，Reed-Sternberg cells 異常大顆且細胞核超過一個。Non-Hodgkin Lymphoma ( NHL ) 則源於 B 細胞或 T 細胞，NHL 可以擴散到淋巴結裡，也能轉移到其它器官。兩者的病理型態學及臨床表現具有差異。西方人常見 Hodgkin Lymphoma ( HL )，預後較好。東方人較多 Non-Hodgkin Lymphoma ( NHL )，發生率為 HL 的 9 倍。
Non-Hodgkin Lymphoma ( NHL ) 主要分為 B 細胞淋巴瘤、T 細胞淋巴瘤及 NK / T 細胞淋巴瘤三大類，其中 B 細胞淋巴瘤佔美國的 NHL 達 9 成，主要為彌漫性大 B - 細胞淋巴瘤 ( diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL ) 及濾胞性淋巴瘤 ( follicular lymphoma )，NK / T 細胞淋巴瘤則較罕見。大部份 Non-Hodgkin Lymphoma 的 B 細胞淋巴瘤細胞表面具有 CD20 獨特抗原，該抗原已有 Rituximab 單株抗體 ( monoclonal antibody, mab ) 可進行免疫治療，它也能與其他化療藥物結合運用，Rituximab 及化學治療的結合運用，已成為 B - 細胞淋巴瘤的重要治療法。
腫瘤突變負荷 ( tumor mutation burden, TMB ) 為新興的癌症重要評估指標之一，TMB 可應用於免疫治療的反應性評估 ( 關於 TMB 在精準醫療的進展與應用，請看：美國 FDA WES TMB 標準化 加速免疫治療應用與發展 )。 TMB 數值與癌細胞的 DNA 突變數量相關，TMB 數值越大、蛋白質突變數越多，免疫治療反應性可能越佳，因此，TMB 成為癌症個人化治療的重要評估數值，許多臨床檢測、治療開發，都會比較不同臨床型態患者的 TMB 數值，評估是否能以 TMB 來作為治療依據。
韓國首爾三星醫療中心 ( Samsung Medical Center ) 於 2019 - 2020 年以 SureSelect custom cancer gene panel 進行 300 位 non-Hodgkin lymphoma 患者 NGS 檢查，驗證 TMB 數值與免疫療法的關聯，相關資訊如下：
● 分析方法
根據先前該單位血液科惡性疾病 ( hematologic malignancies ) 檢測內容基礎，加強 non-Hodgkin lymphoma 相關基因，設計出 SureSelect NHL 405 gene panel 進行 NGS 分析，找出患者所帶有的 SNV / Indel 突變作為 TMB 數值依據，並比對相關臨床表徵診斷。
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圖一、何杰金氏淋巴瘤 ( Hodgkin lymphoma, HL ) 與 Reed-Sternberg cell 圖片取自 Dana-Farber Cancer Institute 霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的区别是什么？ LYMPHOMA DIFFERENCES |
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圖二、Non-Hodgkin lymphoma ( NHL ) 圖例 - 彌漫性大 B - 細胞淋巴瘤 ( diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL )、濾胞性 B - 細胞淋巴瘤 ( follicular lymphoma ) 及 T 細胞淋巴瘤 圖片取自香港防癌會-淺談淋巴瘤 |
Non-Hodgkin Lymphoma ( NHL ) 主要分為 B 細胞淋巴瘤、T 細胞淋巴瘤及 NK / T 細胞淋巴瘤三大類，其中 B 細胞淋巴瘤佔美國的 NHL 達 9 成，主要為彌漫性大 B - 細胞淋巴瘤 ( diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL ) 及濾胞性淋巴瘤 ( follicular lymphoma )，NK / T 細胞淋巴瘤則較罕見。大部份 Non-Hodgkin Lymphoma 的 B 細胞淋巴瘤細胞表面具有 CD20 獨特抗原，該抗原已有 Rituximab 單株抗體 ( monoclonal antibody, mab ) 可進行免疫治療，它也能與其他化療藥物結合運用，Rituximab 及化學治療的結合運用，已成為 B - 細胞淋巴瘤的重要治療法。
腫瘤突變負荷 ( tumor mutation burden, TMB ) 為新興的癌症重要評估指標之一，TMB 可應用於免疫治療的反應性評估 ( 關於 TMB 在精準醫療的進展與應用，請看：美國 FDA WES TMB 標準化 加速免疫治療應用與發展 )。 TMB 數值與癌細胞的 DNA 突變數量相關，TMB 數值越大、蛋白質突變數越多，免疫治療反應性可能越佳，因此，TMB 成為癌症個人化治療的重要評估數值，許多臨床檢測、治療開發，都會比較不同臨床型態患者的 TMB 數值，評估是否能以 TMB 來作為治療依據。
韓國首爾三星醫療中心 ( Samsung Medical Center ) 於 2019 - 2020 年以 SureSelect custom cancer gene panel 進行 300 位 non-Hodgkin lymphoma 患者 NGS 檢查，驗證 TMB 數值與免疫療法的關聯，相關資訊如下：
● 分析方法
根據先前該單位血液科惡性疾病 ( hematologic malignancies ) 檢測內容基礎，加強 non-Hodgkin lymphoma 相關基因，設計出 SureSelect NHL 405 gene panel 進行 NGS 分析，找出患者所帶有的 SNV / Indel 突變作為 TMB 數值依據，並比對相關臨床表徵診斷。
● 分析結果
( 1 ) 突變變異頻率分布
( 2 ) 腫瘤細胞分群的突變量分布
接著比對不同免疫細胞間的 SNV / Indel 突變數 ( TMB 計算基礎 )，先以最基本的 mature B-cell、mature T-cell neoplasms 區別來計算平均突變數，得到 mature B-cell neoplasm 平均 23.98、mature T-cell neoplasm 平均 17.21，具有 P < 0.001 顯著差異的結果 ( Figure 2A )。接著細分不同類型，瀰漫性大 B 細胞淋巴瘤 ( diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL ) 包含最多突變數，其次為 B 細胞腫瘤 ( Mature B-cell lymphoma )，再者是 T 細胞 / NK 細胞腫瘤 ( Mature T-/NK-cell lymphoma )。接著觀察各類免疫淋巴瘤 SNV / Indel 裡 VAF 在 39-52% 的佔比，顯示雖然各類免疫淋巴瘤的總 SNV / Indel 數量有高低差異，但 VAF 39-52% 這群的數量相對一致無顯著差異 ( Figure 2B )，有很大的機率是遺傳性 Germline mutations。
( 3 ) 臨床癌症分期與診斷
依前述三淋巴瘤類群，分析不同類群的突變量，與臨床癌症分期關係 ( Figure 3B, 4B, 5B )、病情、或診斷狀態 ( Figure 3C, 4C, 5C )。不同類型的淋巴瘤有不同的突變數量，可能可以反應腫瘤的不同臨床病理特徵。利用 SNV / Indel ( 或 TMB ) 數值再搭配其他的 biomarkers，未來是有機會協助臨床選擇醫療策略。
Whole exome sequencing ( WES ) 雖為癌症 TMB 測量的標準方法，但臨床診斷需要更快速、經濟的做法，此研究結果顯示精確設計的小型 gene panel，除了能針對關鍵突變進行檢測，獲得更有效益、協助診斷的結果外，也可以獲得合理的 TMB 數值，進行下一步臨床應用研究。
【參考資料】
( Dana-Farber Cancer Institute )
1. https://www.dana-farber.org/non-hodgkin-lymphoma/about/
2. https://reurl.cc/vdEyGL
( 財團法人台灣癌症基金會 )
3. https://www.canceraway.org.tw/page.php?IDno=2223
(香港防癌會-淺談淋巴瘤)
4. https://www.hkacs.org.hk/ufiles/Lymphoma.pdf
5. https://bmccancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12885-021-08695-7
( 1 ) 突變變異頻率分布
VAF ( variant allele frequency, 變異頻率 ) 在 39 - 52% 之間出現數量最多 ( Green Bar )，這個 VAF 區段跟遺傳性 SNV 的可能 VAF% 值重疊。將 VAF <5% 且 total read <100 的突變排除後，整體的 SNV / Indel 平均數量為 22.68 ( 6804 / 300 )。
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| Figure 1. Number of SNV/Indel according to variant allele frequency in 300 cases. Red bars are the section with variant allele frequency less than 5%. Green bars are the section estimated to contain lots of germline mutations. |
( 2 ) 腫瘤細胞分群的突變量分布
接著比對不同免疫細胞間的 SNV / Indel 突變數 ( TMB 計算基礎 )，先以最基本的 mature B-cell、mature T-cell neoplasms 區別來計算平均突變數，得到 mature B-cell neoplasm 平均 23.98、mature T-cell neoplasm 平均 17.21，具有 P < 0.001 顯著差異的結果 ( Figure 2A )。接著細分不同類型，瀰漫性大 B 細胞淋巴瘤 ( diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL ) 包含最多突變數，其次為 B 細胞腫瘤 ( Mature B-cell lymphoma )，再者是 T 細胞 / NK 細胞腫瘤 ( Mature T-/NK-cell lymphoma )。接著觀察各類免疫淋巴瘤 SNV / Indel 裡 VAF 在 39-52% 的佔比，顯示雖然各類免疫淋巴瘤的總 SNV / Indel 數量有高低差異，但 VAF 39-52% 這群的數量相對一致無顯著差異 ( Figure 2B )，有很大的機率是遺傳性 Germline mutations。
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| Figure 2. (A) Scatter plot of number of SNV/Indel for all cases. The horizontal bar represents the median value. (B) Bar graph in which the number of SNV/Indel is arranged in the order of median value. |
( 3 ) 臨床癌症分期與診斷
依前述三淋巴瘤類群，分析不同類群的突變量，與臨床癌症分期關係 ( Figure 3B, 4B, 5B )、病情、或診斷狀態 ( Figure 3C, 4C, 5C )。不同類型的淋巴瘤有不同的突變數量，可能可以反應腫瘤的不同臨床病理特徵。利用 SNV / Indel ( 或 TMB ) 數值再搭配其他的 biomarkers，未來是有機會協助臨床選擇醫療策略。
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Figure 3. (B) SNV/Indel numbers of DLBCL variants compared by Ann-Arbor stage. (C) SNV/Indel numbers of DLBCL variants between tumors at diagnosis and relapsed/refractory tumors. DLBCL (diffuse large B-cell lymphoma); CNS (central nervous system); NOS (not otherwise specified); GCB (germinal center B-cell); ABC (activated B-cell); MALT (mucosa-associated lymphoid tissue); EBV (Epstein-Barr virus); PMLBL (primary mediastinal large B-cell lymphoma); HGBCL (high-grade B-cell lymphoma) Figure 4. (B) SNV/Indel numbers of mature B-cell lymphoma except DLBCL variants compared by Ann-Arbor stage. (C) SNV/Indel numbers of mature B-cell lymphoma except DLBCL variants between tumors at diagnosis and relapsed/refractory tumors. MALT (mucosa-associated lymphoid tissue); CLL/SLL (chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma); FL (follicular lymphoma); MALToma (extranodal marginal zone lymphoma of MALT); MCL (mantle cell lymphoma); LPL (lymphoplasmacytic lymphoma); NMZL (nodal marginal zone lymphoma) Figure 5. (B) SNV/Indel numbers of T- and NK-cell lymphomas compared by Ann-Arbor stage. (C) SNV/Indel numbers of T- and NK-cell lymphoma between tumors at diagnosis and relapsed/refractory tumors. PTCL (peripheral T-cell lymphoma); NOS (not otherwise specified); TFH (T follicular helper cell); ALCL (anaplastic large cell lymphoma); ALK (anaplastic lymphoma kinase); ENKTL (extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type); AITL (angioimmunoblastic T-cell lymphoma); FTCL (follicular T-cell lymphoma) |
Whole exome sequencing ( WES ) 雖為癌症 TMB 測量的標準方法，但臨床診斷需要更快速、經濟的做法，此研究結果顯示精確設計的小型 gene panel，除了能針對關鍵突變進行檢測，獲得更有效益、協助診斷的結果外，也可以獲得合理的 TMB 數值，進行下一步臨床應用研究。
( Dana-Farber Cancer Institute )
1. https://www.dana-farber.org/non-hodgkin-lymphoma/about/
2. https://reurl.cc/vdEyGL
( 財團法人台灣癌症基金會 )
3. https://www.canceraway.org.tw/page.php?IDno=2223
(香港防癌會-淺談淋巴瘤)
4. https://www.hkacs.org.hk/ufiles/Lymphoma.pdf
5. https://bmccancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12885-021-08695-7
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