日本病理學會NGS臨床樣品處理方法 — DNA篇

臨床樣品為了能長期保存,大多以 FFPE ( Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded ) 方式處理,以利未來病理研究或後續診斷使用。不過,使用福馬林固定樣本,同時也有破壞核酸結構的可能,因此針對 FFPE 樣品的準備、保存,是維持核酸完整性、高品質的關鍵步驟。

【圖一】臨床樣品處理概要流程

為了維持 FFPE-DNA 的質與量,自樣本取得、FFPE 處理、至萃取核酸都會影響最終核酸品質的好壞,此篇針對 FFPE 處理(固定→長期儲存)詳細說明。依據日本病理學會 ( The Japanese Society of Pathology, 簡稱 JSP ) 對於定序樣品前端處理之建議:

(1)取樣

預計進行必要的 FFPE 處理,應盡快固定樣本,若無法立刻進行,必須立即把手術切除的組織存放4℃冰箱,且避免在室溫下超過30分鐘;並在1小時內進行固定,切勿超過3小時。
另外,若使用內視鏡取樣或通過活組織切片收集的樣本,需要立即浸入固定劑中並固定。

(2)FFPE 處理

固定:
固定樣本的影響條件包含固定液的種類、濃度、pH,固定時間、溫度,固定時的試劑/組織之間的比例,以及固定液的滲透方式。在不同的處理條件下,通過 Agilent TapeStation 測定核酸品質標準 — DIN value(如圖二),獲得數值越高,核酸完整性、品質越高,可以推估建庫成功的機會越高,DIN > 2.3 具有 70% 的 amplicon 建庫成功率。考量以上,若後續欲萃取 FFPE-DNA,JSP 建議使用 10% 甲醛中性緩衝液 ( NBF, Neutral Buffered Formalin ) 固定組織樣本(如圖二紅箭頭處),固定6 – 48 hr(如圖三),且固定劑的使用量建議取在組織量的10倍。

儲存:
將處理完畢之 FFPE 樣品分別保存在室溫或 4℃ 一段時間,DNA 質量(如圖四(a))均達 JSP 設定的樣品建庫水準 — DIN > 2.3(如圖二),因此樣品可允許存放室溫陰涼處;但若預計做 NGS 實驗,則建議放在 4℃,並且每一次樣品準備需要重新切片,避免使用已切片一段時間的樣本。

另外有關硬組織樣品固定時間不宜過長,固定後需要以 EDTA 脫鈣再長期儲存之,可以留存較好的 DNA 質與量(如圖五紅箭頭處)。

下篇將接續介紹 FFPE-RNA 處理方法)


【圖二】JSP 建議使用 10% NBF 處理 FFPE 樣本,可萃取較高品質 ( DIN 值高 ) 的 DNA

【圖三】最佳固定時間為 6 – 48 hr,過度固定 ( D3, D7, D14 ) 會減少 DNA 濃度


【圖四】FFPE 樣品可存於室溫 ( RT ),NGS 實驗樣品建議 4℃ 保存


【圖五】硬組織樣品的固定時間適當並以 EDTA 脫鈣,可以維持 DNA 的完整、減少降解程度

(3)核酸萃取

包含切片、選樣、核酸萃取步驟核酸萃取更詳細內容請見後續文章),最後必須進行樣品 QC,確保後續基因分析的可信度。

日本病理學會《基因組醫學病理組織標本處理規定》對於定序樣品前處理之建議:

準備高品質的樣品絕對是獲得高品質數據的必要條件,因此,臨床樣品長期保存的同時,也需維持其樣品的品質,取得足量、完整的 DNA。藉由 JSP 提供優化的 FFPE-DNA 處理辦法,可以調整應用於臨床 NGS 樣品準備,並且標準化之,建立一套臨床樣品處理的 SOP,將可幫助取得高品質的樣品,落實 NGS 臨床實用化的目標。


【參考資料】
  1. Yae Kanai. (2018) The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International, 68 (2) 63-90. 
  2. 日本病理學會:https://pathology.or.jp/

留言