臨床樣品為了能長期保存，大多以 FFPE ( Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded ) 方式處理，以利未來病理研究或後續診斷使用。不過，使用福馬林固定樣本，同時也有破壞核酸結構的可能，因此針對 FFPE 樣品的準備、保存，是維持核酸完整性、高品質的關鍵步驟。
【圖一】臨床樣品處理概要流程
為了維持 FFPE-DNA 的質與量，自樣本取得、FFPE 處理、至萃取核酸都會影響最終核酸品質的好壞，此篇針對 FFPE 處理（固定→長期儲存）詳細說明。依據日本病理學會 ( The Japanese Society of Pathology, 簡稱 JSP ) 對於定序樣品前端處理之建議：
（1）取樣
預計進行必要的 FFPE 處理，應盡快固定樣本，若無法立刻進行，必須立即把手術切除的組織存放4℃冰箱，且避免在室溫下超過30分鐘；並在1小時內進行固定，切勿超過3小時。
另外，若使用內視鏡取樣或通過活組織切片收集的樣本，需要立即浸入固定劑中並固定。
（2）FFPE 處理
固定：
固定樣本的影響條件包含固定液的種類、濃度、pH，固定時間、溫度，固定時的試劑/組織之間的比例，以及固定液的滲透方式。在不同的處理條件下，通過 Agilent TapeStation 測定核酸品質標準 — DIN value（如圖二），獲得數值越高，核酸完整性、品質越高，可以推估建庫成功的機會越高，DIN > 2.3 具有 70% 的 amplicon 建庫成功率。考量以上，若後續欲萃取 FFPE-DNA，JSP 建議使用 10% 甲醛中性緩衝液 ( NBF, Neutral Buffered Formalin ) 固定組織樣本（如圖二紅箭頭處），固定6 – 48 hr（如圖三），且固定劑的使用量建議取在組織量的10倍。
儲存：
將處理完畢之 FFPE 樣品分別保存在室溫或 4℃ 一段時間，DNA 質量（如圖四(a)）均達 JSP 設定的樣品建庫水準 — DIN > 2.3（如圖二），因此樣品可允許存放室溫陰涼處；但若預計做 NGS 實驗，則建議放在 4℃，並且每一次樣品準備需要重新切片，避免使用已切片一段時間的樣本。
另外有關硬組織樣品固定時間不宜過長，固定後需要以 EDTA 脫鈣再長期儲存之，可以留存較好的 DNA 質與量（如圖五紅箭頭處）。
（下篇將接續介紹 FFPE-RNA 處理方法）
【圖二】JSP 建議使用 10% NBF 處理 FFPE 樣本，可萃取較高品質 ( DIN 值高 ) 的 DNA
【圖三】最佳固定時間為 6 – 48 hr，過度固定 ( D3, D7, D14 ) 會減少 DNA 濃度
【圖五】硬組織樣品的固定時間適當並以 EDTA 脫鈣，可以維持 DNA 的完整、減少降解程度
（3）核酸萃取
包含切片、選樣、核酸萃取步驟（核酸萃取更詳細內容請見後續文章），最後必須進行樣品 QC，確保後續基因分析的可信度。
日本病理學會《基因組醫學病理組織標本處理規定》對於定序樣品前處理之建議：
準備高品質的樣品絕對是獲得高品質數據的必要條件，因此，臨床樣品長期保存的同時，也需維持其樣品的品質，取得足量、完整的 DNA。藉由 JSP 提供優化的 FFPE-DNA 處理辦法，可以調整應用於臨床 NGS 樣品準備，並且標準化之，建立一套臨床樣品處理的 SOP，將可幫助取得高品質的樣品，落實 NGS 臨床實用化的目標。
【參考資料】
- Yae Kanai. (2018) The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International, 68 (2) 63-90.
- 日本病理學會：https://pathology.or.jp/
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