HMW-DNA 與三代定序的全新應用 ( 2 )

藉著可定序長片段分子的技術特長，三代定序技術在 Genomics, Transcriptome, Epigenomics, Metagenomics 等…領域中，作為其特殊研究應用的重要工具 ( 特殊應用介紹請看前篇 HMW-DNA 與三代定序的全新應用 ) ，快速、有效發現大型而複雜的遺傳變異。

為了解決這些特定的研究需要，即使現有的兩大三代定序平台已逐漸發展成熟，依然存在著極大的挑戰，一是準備合適的樣品、二是選擇合適的定序方式與規格，才可獲取具有參考價值的結果。而此篇著重討論三代定序的樣品需求，關鍵為取得完整的長片段核酸並檢測樣品品質，是定序實驗關鍵的第一步 ( 圖一 ) ，過度降解的 DNA 不適於後續定序使用，樣品越破碎，越不容易定序到長片段而影響後續針對長片段分子的定序效果；因此，使用純度越高、完整度越佳的 HMW-DNA 有助於定序效能更良好的表現，同時減少浪費後續更多的實驗資源。

【圖一】三代定序 Pacific Bioscience ( PacBio ) 對於 HMW-DNA 樣品條件需求建議

HMW-DNA 被認為是進行長片段定序的最適樣品，亦可應用於多項研究需求：

1. de novo assembly：

礙於 NGS 短片段定序在遇到基因體重複序列區域時，無法有效進行基因體組裝，在 Reference Genome GRCh38 中，尚包含許多無序列資料的 gap ( 圖二a ) ，使用 HMW-DNA 進行定序，可有效組裝基因體，解開 gap 未知的序列 ( 圖二b ) 。

【圖二】HMW-DNA 與三代定序於 de novo assembly 應用。 ( a ) Length distribution of all gaps in GRCh38. ( b ) Length distribution of all gaps that can be fully or partially closed.

2. Metagenomics：

短片段定序無法有效區別 homologous sequence ( 圖三a ) ，透過長片段 DNA 序列資訊比對，可更清晰分辨細菌 plasmid 及 chromosome 差異性，並進階應用於環境微生物族群分析 ( 圖三b ) 。

【圖三】HMW-DNA 與三代定序應用於 Metagenomics 研究。 ( a ) PACBIO N50 ~ 202 kb，short reads N50 ~ 4 kb。 ( b ) PacBio 用於腸道微生物多樣性分析。

3. Structural Variation：

結構變異指長度 > 50 bp 的變異，由於 NGS 讀取序列短，基因體組裝效率不完全，尤其在真實結構變異發生時，這些已破碎 short reads 無法比對看出原始 DNA 上的結構變異，透過 HMW-DNA 定序，較能有效偵測大型結構變異 ( 圖四 ) 。

【圖四】HMW-DNA 與三代定序應用於 Structural Variation 分析。 ( a ) 偵測 Chromosome 上 large-scale deletions ( 藍處 ) 與 insertions ( 紅處 ) 。 ( b ) 不同種類結構變異分析：complex, multiple repeat elements are found; MEI, mobile element insertion; STR, short tandem repeat。

4. DNA Modification：

傳統偵測 DNA modifications 使用化學方式事先處理樣品，往往損壞了核酸的完整度與產量，長片段定序能夠觀察較完整的 HMW-DNA 上的多處修飾，並且在重複序列區域也能有效分析特定的修飾位置，或幫助解析短序列 unmapped 區域的序列 ( 圖五 ) 。

【圖五】HMW-DNA 與三代定序 ( PacBio-SMRT 及 Nanopore ) 應用於 DNA methylation 分析。

了解 HMW-DNA 多種定序應用後，使用 RevoluGen FireMonkey / FireFlower 可以快速、簡單萃取到完整 HMW-DNA，滿足三代定序樣品之需求。此實驗套組利用 Fire Monkey 的管柱純化 ( spin column ) 法，萃取長度 100kb 或更長的 HMW-DNA ( 圖六 ) ，並透過 Fire Flower 有效分離小於 10kb 的 DNA 片段，一小時內完成 HMW-DNA 萃取 ( 圖七 ) ，適用於全基因體定序或其他長片段核酸分析應用。

【圖六】RevoluGen Fire Monkey ( 紅 ) 萃取更多、更完整、更長的 HMW-DNA。

【圖七】RevoluGen Fire Flower 進行 size selection，集中萃取更長片段的完整 DNA，有效提升定序讀長平均、N50、>50kb 片段 reads number。

【參考資料】

1. NATURE COMMUNICATIONS | 7:12065 | DOI: 10.1038/ncomms12065

2. Suzuki et al. Microbiome (2019) 7:119｜https://doi.org/10.1186/s40168-019-0737-z

3. Genome Biology volume 21, Article number: 54 (2020)